2型糖尿病猕猴模型创建及骨髓间充质干细胞移植治疗

发布时间：2017-08-17 05:29

  本文关键词：2型糖尿病猕猴模型创建及骨髓间充质干细胞移植治疗

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【摘要】：目的：1.体外培养、鉴定猕猴骨髓间充质干细胞,并用SPIO和DAPI双标记骨髓间充质干细胞；2.建立2型糖尿病猕猴模型的制作及评价方法；3.将SPIO和DAPI双标记的骨髓间充质干细胞经胰尾动脉移植治疗2型糖尿病猕猴,观察骨髓间充质干细胞在体内的分布、分化情况,及对2型糖尿病猕猴的治疗效果。方法：1.猕猴骨髓间充质干细胞的培养、鉴定及标记：健康5岁龄猕猴麻醉后,行髂后上棘骨髓穿刺获得骨髓15ml,采用全骨髓贴壁法分离培养得到贴壁的骨髓间充质干细胞,采用细胞形态观察及流式细胞术对骨髓间充质干细胞进行鉴定。当第3代骨髓间充质干细胞融合达80%,加入SPIO(?)DAPI溶液培养24h后,通过普鲁士蓝染色和透射电镜鉴定SPIO标记阳性率；通过荧光显微镜观察DAPI标记阳性率。2.2型糖尿病猕猴模型的建立：将12只健康猕猴随机分为正常对照组(对照组,n=3)：不做任何处理；糖尿病模型组(模型组,n=9)：给予高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素(30mg/kg)造模。再将糖尿病模型组分为两组：模型对照组(模型对照组,n=3)：模型对照组注入2mL生理盐水；骨髓间充质干细胞治疗组(治疗组,n=6)：将其随机分为两组即治疗A组：注入双标记的骨髓间充质干细胞悬液；治疗B组：注入未标记的骨髓间充质干细胞悬液。3.SPIO和DAPI双标记的骨髓间充质干细胞移植治疗2型糖尿病猕猴的疗效评价：将SPIO和DAPI双标记的猕猴骨髓间充质干细胞通过胰尾动脉移植入治疗组猕猴,并于移植后3、7、14、21天(d)行MR扫描,通过扫描到的信号变化印证标记的干细胞在体内的分布情况；移植后1、6周(w)采集外周血血清测定空腹血糖(FBG)、血脂、胰岛素、C-肽水平,通过静脉葡萄糖耐量试验(IVGTT)、C-肽释放试验(ACR)检测胰腺胰岛功能；移植后4w取胰腺、肾脏、肝脏组织行病理组织学检查,行常规HE染色、普鲁士蓝染色及荧光染色,观察移植细胞在体内的分布情况。结果：1.细胞形态观察及鉴定结果：原代骨髓间充质干细胞培养3-4d后细胞分裂增殖明显,出现形态均一的细胞增殖集落,培养至10-14d,80%以上细胞趋于融合,呈典型的长梭形、漩涡状成纤维细胞样形态,分布均匀。第3代干细胞经流式细胞术检测：贴壁细胞均高表达CD29、CD44、CD90、CD105,低表达造血细胞表型CD31、CD34。2.SPI0和DAPI双标记的干细胞鉴定结果：DAPI标记第3代干细胞12h后,荧光显微镜下,可见细胞核发明亮蓝色荧光,标记阳性率达98%；SPIO标记干细胞24h,普鲁士蓝染色可见95%干细胞胞质内有大量蓝色致密颗粒分布。透射电镜显示标记的BMSCs胞质中有高密度的铁粒子密集,细胞质中存在的小囊泡状结构内摄入高密度的铁粒子。3.模型组猕猴血生化指标变化情况：从造模前到造模后12w,模型组猕猴FBG由(3.6±0.8)mmol/L升高至(21.5±4.1)mmol/L;外周血中胰岛素、C-肽显著降低；血脂显著升高,与对照组相比均具有显著性差异(p0.05)；IVGTT可见曲线下面积明显增加；ACR可见曲线下面积明显减小。4.模型组猕猴胰腺、肝脏、肾脏组织病理学观察结果：模型组胰腺切片HE染色、PAS染色及masson染色可见胰岛数目减少,胰岛萎缩,结构被破坏,有大量的糖原沉积等糖尿病胰腺病变；模型组猕猴肝脏切片HE染色、PAS染色可见肝小叶结构破坏,肝索排列紊乱,窦间隙变窄,肝细胞体积增大,肝细胞脂肪变性,伴有肝细胞坏死,及大量糖原沉积等肝细胞脂肪病变；模型组肾脏切片HE染色、PAS染色及(?)masson染色可见肾系膜明显增厚,肾小球肥大,有大量的糖原沉积等典型糖尿病肾脏病变。而对照组胰腺、肝脏及肾脏组织未见病变。5.移植双标记的干细胞体内分布情况：与模型对照组及对照组相比,治疗组于标记的干细胞移植后3、7、14d MR检查可见胰腺、肾脏组织影像学信号改变。标记的干细胞移植后4w组织病理切片示,胰腺、肾脏组织切片经普鲁士蓝染色可见普鲁士蓝蓝染细胞；经荧光染色后荧光显微镜下可见蓝色荧光信号细胞。6.干细胞移植后生化指标变化情况：干细胞移植后第6w FBG由移植前的(21.5±4.1)mmol/L降至(11.4±2.1)mmol/L,外周血中胰岛素、C-肽明显升高；血脂明显下降,与模型对照组相比差异均具有显著意义(p0.05)。IVGTT可见曲线下面积明显减小；ACR可见曲线下面积明显增加。结论：1.采用全骨髓贴壁法成功分离培养获得高纯度猕猴骨髓间充质干细胞,纯度达95.1%。2.SPIO和DAPI成功标记骨髓间充质干细胞,标记阳性率达95%～98%。3.成功建立了高糖高脂饮食联合小剂量链脲佐菌素诱导2型糖尿病猕猴模型的制作方法,其成模率达.100%。4.骨髓间充质干细胞移植治疗2型糖尿病猕猴能降低血糖、血脂,减轻胰岛素抵抗；通过磁共振活体示踪及内脏组织病理学观察标记的细胞在胰腺、肾脏的分布,说明骨髓间充质干细胞移植治疗2型糖尿病是有效的。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 2型糖尿病 猕猴 SPIO STZ
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.1;R-332
【目录】：

• 主要缩略名称中英文对照表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 1 材料与方法17-28
• 1.1 实验材料17-20
• 1.2 实验方法20-27
• 1.3 统计学处理27-28
• 2 结果28-41
• 2.1 BMSCs的培养和扩增结果28
• 2.2 BMSCs表面标志物分析结果28-30
• 2.3 DAPI标记的BMSCs结果30
• 2.4 SPIO标记的BMSCs鉴定结果30-31
• 2.5 DAPI和SPIO双标记对BMSCs形态的影响31
• 2.6 MTT法检测标记的BMSCs增殖活力变化31
• 2.7 T2DM称猴模型的评价31-32
• 2.8 空腹血糖变化情况32
• 2.9 静脉葡萄糖耐量试验结果32-33
• 2.10 C-肽释放试验结果33
• 2.11 血生化指标变化情况33-34
• 2.12 磁共振活体成像示踪结果34-35
• 2.13 病理学观察结果35-40
• 2.14 移植双标记的细胞体内分布情况40-41
• 3 讨论41-45
• 3.1 BMSCs作为治疗2型糖尿病种子细胞的优势41
• 3.2 2型糖尿病模型动物的选择及制作41-42
• 3.3 干细胞标记方案的选择及其安全性的检测42-43
• 3.4 SPIO标记的干细胞MR活体成像43-45
• 4 结论45-46
• 参考文献46-50
• 综述50-56
• 参考文献54-56
• 在读期间发表论文56-57
• 致谢57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

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本文编号：687367