新型核酸检测系统用于高通量诊断多种呼吸道病毒的研究

发布时间：2017-08-17 05:21

  本文关键词：新型核酸检测系统用于高通量诊断多种呼吸道病毒的研究

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【摘要】：研究背景与目的：呼吸道感染是世界范围的常见病,主要是由呼吸道病毒及一些细菌、支原体、衣原体等引起。病毒中最常见的是流感病毒、冠状病毒、呼吸道合胞病毒等,通常会引起婴幼儿、老人及免疫受损病人严重的上下呼吸道感染,导致哮喘、细支气管炎、肺炎等,而且极易引起流行或爆发,具有很高的发病率和死亡率。其临床表现相似,这给及时、准确地诊断呼吸道传染病、控制疫情带来很大的挑战。 目前,很多病毒学诊断实验室联合使用病毒培养、免疫荧光染色以及分子诊断方法来检测呼吸道病毒。但是病毒培养周期长,对实验室条件要求高；免疫荧光染色的灵敏度及抗血清的可获性是其主要限制因素；分子诊断方法,最常用的是核酸检测,由于其要求提取样本核酸,并对核酸进行逆转录、标记或扩增等步骤,操作复杂,误差较大,很难高通量进行。本课题旨在建立一种简单、灵敏、特异而且准确稳定的大规模高通量多病原检测方法,适用于大规模的呼吸道病毒的筛查和流行病学调查研究。 研究方法：我们直接以病毒RNA作为检测靶标,通过简单样本裂解释放RNA,利用以微球为基础的高通量xMAP技术捕获靶标RNA：然后联合应用线性oligo DNA分子放大信号方式,对同一个样本同时进行11种呼吸道病毒指标的检测,包括甲、乙型流感病毒(fluA/fluB),甲、乙型呼吸道合胞病毒(RSVA/RSVB)、偏肺病毒(MPV),冠状病毒229E/HKU,1、2、3型副流感病毒(piv1/piv2/piv3)、甲型鼻病毒(HRVA)。首先,我们根据11种靶标病毒的特异保守区段分别设计一套探针和引物；然后对从北京疾控中心取回的11种常见呼吸道病毒核酸进行RT-PCR/PCR扩增,克隆得到质粒,测序正确后进行转录,得到序列和浓度已知的靶标RNA,4倍系列梯度稀释,摸索最优反应条件,评价所建立方法的敏感性和特异性。最终确定最优实验条件,并对2006-2010年采集的180例咽拭子样本进行检测,检测结果与RT-PCR方法比较。 研究结果：成功获得11种病毒的靶标RNA,并确定了最优的反应条件。IVT-RNA实验表明本方法可以正确区分11种常见呼吸道病毒,彼此之间无交叉反应；检测下限均低于或等于4695个RNA拷贝。180例咽拭子样本中,高通量方法与RT-PCR方法均为阳性的样本为102例,另外有20例仅RT-PCR方法检测阳性。统计学分析两种检测方法检出率无显著差异(P--0.22)。 研究结论本研究成功建立了可靠、灵敏、操作简便、高通量的多种呼吸道病毒并行检测方法,适用于大样本量呼吸道病毒检测,为呼吸道疾病监控和流行病学研究提供有力工具。
【关键词】：呼吸道病毒 体外转录RNA 高通量 信号放大
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.1;R440
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 英文缩略语7-8
• 第一章 综述8-19
• 1. 呼吸道病毒介绍8-10
• 2. 呼吸道病毒检测技术介绍10-15
• 3. 本研究的主要内容和意义15-19
• 第二章 材料与方法19-31
• 一.实验材料19-20
• 二.实验方法20-31
• 1. 技术路线与实验方法20-21
• 2. 样本制备21-28
• 3 检测流程28-30
• 4 检测系统特异性评价30
• 5 检测系统灵敏度评价30
• 6 咽拭子样本检测30
• 7 统计学方法30-31
• 第三章 实验结果31-40
• 第四章 讨论40-44
• 结论44-45
• 参考文献45-49
• 附录49-55
• 致谢55-56
• 个人简历56-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：687312