组织型转谷氨酰胺酶在日本血吸虫感染所致肝纤维化及肺癌耐药合并转移中的作用

发布时间：2017-08-17 19:04

  本文关键词：组织型转谷氨酰胺酶在日本血吸虫感染所致肝纤维化及肺癌耐药合并转移中的作用

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【摘要】：研究背景与目的： 组织型转谷氨酰胺酶(tissue transglutaminase，tTG)是转谷氨酰胺酶家族中的一种多功能蛋白酶，分子量为80kDa，它作为钙离子依赖酶，能够催化蛋白质的谷氨酰胺残基与赖氨酸残基交联；能够结合、水解GTP参与细胞内外信号转导；也可作为支架蛋白结合整合素、纤连蛋白等；或发挥蛋白激酶、蛋白质二硫键异构酶的作用。已有研究发现tTG与伤口愈合与修复、细胞凋亡、炎症反应、细胞周期调控以及纤维化和癌症等多种生理病理过程相关。本研究旨在研究tTG在日本血吸虫感染所致肝纤维化及肺癌耐药合并转移中的作用。 研究方法： （1）实验动物及日本血吸虫感染致肝纤维化动物模型的建立SPF级雌性BALB/c小鼠70只，6~8周龄，随机分成正常对照组（10只）与实验组（60只）。实验组随机取其中50只鼠，每只鼠经腹部皮肤贴片法感染日本血吸虫尾蚴203条，于感染后5、6、8和12周分别剖杀10只，另10只鼠感染3天后经腹腔注射tTG抑制剂胱胺（cystamine，CTM），100μl/只，浓度10-2mmol/L,每天一次，连续给药7天，于感染后8周剖杀，同时设立未感染CTM治疗组（10只）。 （2）动物标本的处理收集对照组及各实验组小鼠肝组织及血清。血清-20°C保存待用。肝组织一部分用于RNA和蛋白提取，一部分用于制备石蜡切片。 （3）肺癌细胞株的处理收集A549肺癌细胞株和耐受顺铂的A549肺癌细胞株(A549-cisplatinum-resistance，A549-CDDPR)，分别提取RNA和制备细胞裂解液。对A549-CDDPR,用tTG小干扰RNA(Small interfering RNA，siRNA)转染,阴性对照（NC）siRNA转染作为对照。 （4）实验方法用Masson染色法检测肝脏胶原的多少；应用免疫组化、逆转录PCR、荧光定量PCR和Western Blot检测肝组织内α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、tTG、转化生长因子-β1（Transforming growthfactor β1，TGF-β1）和白细胞介素（interleukin，IL）13的表达水平；酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清中TGF-β1和IL-13浓度；应用荧光定量PCR和Western Blot及细胞免疫荧光法检测各肺癌细胞株tTG的表达；免疫组化检测人肺癌组织芯片tTG的表达；Transwell法（不加/加matrigel）分别检测肺癌细胞的迁移力和侵袭力；MTS法检测肺癌细胞的存活。 研究结果： （1）日本血吸虫感染后第5、6、8周肝脏胶原面积逐渐增大、肝星状细胞表达α-SMA逐渐增多，第8周最严重，相对于第8周，第12周胶原面积变小，α-SMA阳性表达降低。相对于未感染组，感染后5、6、8、12周小鼠肝组织内tTG表达增加，且主要表达在肝内门脉系统周围细胞以及虫卵肉芽肿、纤维组织及其周围肝细胞及炎性细胞浸润区域；tTG抑制剂CTM处理后，日本血吸虫感染8w小鼠肝脏胶原面积显著减少，α-SMA阳性表达降低。血吸虫感染后5、6、8、12周小鼠血清和肝脏局部TGF-β1蛋白表达水平升高，但小鼠TGF-β1的RNA表达水平下降，日本血吸虫TGF-β1RNA表达水平上升；tTG抑制剂CTM治疗后，血清和肝脏TGF-β1蛋白表达水平下降。血吸虫感染后5、6、8、12周小鼠血清和肝脏局部IL-13水平升高，tTG抑制剂CTM治疗后，IL-13总RNA表达水平下降，血清中IL-13水平下降，肝脏IL-13表达减少。 （2）顺铂对A549和A549-CDDPR的半数抑癌浓度（half maximal inhibitoryconcentration，IC50）分别为1.40ug/μl、36.67μg/μl；20×光学显微镜下A549、A549-CDDPR细胞迁移平均数分别为44.6±5.3个、229.67±27.34个，细胞侵袭平均数分别为55.33±5.96个、359.0±36.87个， P0.05，差异有统计学意义。A549-CDDPR细胞的tTG水平明显高于A549，P0.05，差异有统计学意义；人肺癌组织芯片免疫组化检测提示有淋巴结或远处转移患者肺癌组织tTG阳性表达率为72.4%，高于无转移患者（阳性表达率37.6%），P0.01，差异有显著统计学意义。 tTG-siRNA下调A549-CDDPR细胞株tTG的表达后，细胞存活率为50.94±5.59%，而NC-siRNA转染A549-CDDPR细胞的存活率为92.60±5.32%，，P0.01，差异有显著统计学意义；20×光学显微镜下5个视野中，NC-siRNA处理A549-CDDPR细胞株、tTG-siRNA转染A549-CDDPR细胞株平均迁移数分别为200.8±24.43个、103±13.10个，细胞平均侵袭数分别为337±22.2个、114.6±15.24个，P0.05，差异有统计学意义。 结论： 第一部分 （1）日本血吸虫感染后第5周小鼠肝脏出现少量纤维化，随后纤维化逐渐加重，第8周纤维化最严重，感染后第12周已进入慢性肝纤维化期。 （2）日本血吸虫感染后，tTG水平随肝纤维化程度加重而升高，tTG抑制剂-胱胺（CTM）可以抑制日本血吸虫感染所致的肝纤维化；因此tTG在日本血吸虫感染所致肝纤维化中起重要作用。 （3）日本血吸虫感染后，TGF-β1水平与肝纤维化程度呈正相关，日本血吸虫源性TGF-β1的高转录可能是日本血吸虫感染后肝脏和血液中高TGF-β1的成因。 （4）日本血吸虫感染后，IL-13水平与肝纤维化程度呈正相关。 （5） tTG可能通过调控TGF-β1和IL-13的水平，进而在日本血吸虫肝纤维化中起作用。 第二部分 （1） A549顺铂耐药细胞株（A549-CDDPR）相比于A549，不仅耐受高浓度的 顺铂，而且具有高的迁移力和侵袭力； （2） tTG表达与肺癌患者的转移发生呈正相关； （3） A549-CDDPR细胞高表达tTG，tTG-siRNA可以提高A549-CDDPR对顺铂的敏感性，并抑制其迁移力和侵袭力； （4） tTG在肺癌的转移以及具有高迁移、侵袭能力的人肺癌细胞株的耐药中起重要作用。
【关键词】：组织型转谷氨酰胺酶 转化生长因子-β1 白细胞介素13 肝纤维化 肺癌转移 耐药
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 中英文缩略语11-12
• 技术路线12-13
• 前言13-17
• 第一部分 组织型转谷氨酰胺酶在日本血吸虫感染所致肝纤维化中的作用17-45
• 引言17-18
• 材料与方法18-34
• 结果34-42
• 讨论42-44
• 结论44-45
• 第二部分 组织型转谷氨酰胺酶在肺癌耐药合并转移中的作用45-59
• 引言45-46
• 材料和方法46-52
• 结果52-56
• 讨论56-58
• 结论58-59
• 参考文献59-68
• 综述68-78
• 参考文献73-78
• 攻读学位期间取得的研究成果78-79
• 致谢79-80

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 刘浩;廖达光;张天一;李昌琪;王知非;;tTG在脑胶质瘤中的表达及其与微血管密度和细胞增殖的关系[J];江西医学院学报;2006年03期

2 景英霞;邵筱;;血吸虫病肝纤维化的发病机理与治疗进展[J];中国病原生物学杂志;2010年04期

3 ;Cystamine ameliorates liver fibrosis induced by carbon tetrachloride via inhibition of tissue transglutaminase[J];World Journal of Gastroenterology;2007年32期

本文编号：690590