GRIN2B shRNA的构建及其对小鼠NR2B基因沉默效果的实验研究

发布时间：2017-08-19 23:21

  本文关键词：GRIN2B shRNA的构建及其对小鼠NR2B基因沉默效果的实验研究

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【摘要】：目的： 1.设计并构建小鼠NMDA受体NR2B亚基短发卡RNA干扰真核表达载体(GRIN2B shRNA)并鉴定。 2.通过鞘内转染聚乙烯亚胺(PEI)介导的GRIN2B shRNA干扰质粒,研究该干扰质粒对小鼠NR2B基因表达的影响,探讨GRIN2B shRNA干扰质粒用于慢性疼痛治疗的可行性。 方法： 1.根据NMDA受体NR2B亚基mRNA编码序列,设计并合成针对NR2B亚基的特异性RNA干涉片断,将其克隆入pYr-1.1质粒载体,构建NR2B亚基shRNA真核表达载体pYr-1.1-GRIN2B-shRNA,并对其进行酶切和测序鉴定。 2.选用成年雄性C57BL/6小鼠60只,随机分为4组：正常组、生理盐水组、阴性对照组和PEI-shRNA组。于鞘内注射后第7天在小鼠足底皮下注射50μL1%的福尔马林后对其进行疼痛行为学观察,并且取小鼠腰段脊髓分别行RT-PCR、Western Blot检测及免疫组化分析,观察小鼠脊髓NR2B mRNA、蛋白的表达水平及定位。 结果： 1.酶切和测序结果均证明NMDA受体NR2B亚基短发卡RNA已经插入到质粒载体pYr-1.1里。 2.疼痛行为学观察显示：福尔马林所致的Ⅰ相期(急性期)的伤害性反应,在各组中均无差别(p0.05)；与正常组、生理盐水(NS)组、阴性对照(Scr)组相比,PEI-shRNA组Ⅱ相期(强直期)的伤害性反应显著减少(p0.05),而正常组、生理盐水组和阴性对照组比较,无显著性差异(p0.05)。 3.PCR及Western Blot检测小鼠脊髓NR2B mRNA及蛋白的表达显示：与正常组、NS组和Scr组相比,PEI-shRNA组小鼠L4-6段脊髓的NR2B mRNA及蛋白表达水平明显降低(p0.05),而正常组、生NS组和Scr组比较,无显著性差异(p0.05)。 4.免疫组化结果显示：NR2B主要在小鼠L4-6段脊髓背角浅层表达；与正常组、NS组和Scr组相比,PEI-shRNA组小鼠L4-6段脊髓NR2B阳性的细胞数明显减少(p0.05),而正常组、NS组和Scr组比较,无显著性差异(p0.05)。 结论： 1. pYr-1.1-GRIN2B-shRNA干扰质粒构建成功,为后续NR2B作为镇痛靶点的基因治疗奠定了基础。 2.PEI介导的GRIN2B shRNA干扰质粒能够使小鼠脊髓NR2B的表达明显下调。 3.PEI介导的GRIN2B shRNA干扰质粒能够减轻福尔马林引起的Ⅱ相炎性痛,进一步证明NR2B在疼痛的维持与中枢敏化中起重要作用,为疼痛治疗提供了新的方法和思路。
【关键词】：NR2B RNAi 短发卡RNA 疼痛
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 符号说明10-12
• 1 前言12-14
• 2 小鼠GRIN2B shRNA干扰质粒的构建、抽提及鉴定14-26
• 2.1 材料与方法14-19
• 2.1.1 实验材料14-15
• 2.1.2 实验方法15-19
• 2.2 结果19-22
• 2.2.1 重组质粒的酶切鉴定结果19-20
• 2.2.2 重组质粒的测序分析结果20
• 2.2.3 质粒DNA的浓度及纯度的测定结果20-21
• 2.2.4 pYr-1.1质粒及pYr-1.1-GRIN2B-shRNA质粒图谱21-22
• 2.3 讨论22-25
• 2.3.1 siRNA作用位点的选择22-23
• 2.3.2 siRNA的起始碱基与序列长度的选择23
• 2.3.3 siRNA序列中GC含量的选择23
• 2.3.4 siRNA序列3’端碱基的选取原则23-24
• 2.3.5 siRNA启动子的选择24
• 2.3.6 siRNA的合成24-25
• 2.4 结论25-26
• 3 鞘内注射GRIN2B shRNA对小鼠NR2B基因表达的影响26-40
• 3.1 材料与方法26-35
• 3.1.1 实验材料26-28
• 3.1.2 实验方法28-35
• 3.2 结果35-37
• 3.2.1 PEI-GRIN2B-shRNA复合物鞘内注射减轻小鼠福尔马林所致的Ⅱ相疼痛反应35-36
• 3.2.2 逆转录PCR检测L4-6段脊髓NR2B的表达36
• 3.2.3 Western Blot检测L4-6段脊髓NR2B的表达36-37
• 3.2.4 免疫组化检测L4-6段脊髓NR2B的表达37
• 3.3 讨论37-39
• 3.4 结论39-40
• 参考文献40-43
• 综述43-53
• 参考文献48-53
• 在读期间发表论文情况53-54
• 致谢54

【参考文献】

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本文编号：703501