结核分枝杆菌ClpC2蛋白的表达及其特性探讨

发布时间：2017-08-19 23:18

  本文关键词：结核分枝杆菌ClpC2蛋白的表达及其特性探讨

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【摘要】：目的 构建MTB ClpC2基因原核表达质粒，在大肠埃希菌（Escherichia.coli, E.coli）BL21中表达rClpC2蛋白；rClpC2蛋白经亲和层析法纯化后免疫新西兰大白兔，制备兔抗ClpC2多克隆抗体（anti-rClpC2抗血清）；间接ELISA法检测肺结核病人血清中相应的抗原、抗体，判断rClpC2和anti-rClpC2抗血清分别作为检测抗原或抗体的特异性和敏感性，，为结核病早期诊断提供实验依据。在E.coli BL21中过表达重组蛋白，观察E.coli BL21在各种应激条件下的生长情况，为后续深入研究MTB ClpC2蛋白酶的生物学功能奠定实验基础。 方法 1.以MTB H37Rv基因组DNA为模板，PCR扩增ClpC2基因，插入表达载体pET32a(+)中，构建重组原核表达质粒pET32a(+)/ClpC2并转化E.coli BL21，IPTG诱导蛋白表达，利用SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行鉴定。 2.纯化后的rClpC2与等体积的弗氏佐剂充分混合，采用皮下多点注射法免疫新西兰大白兔，于第五次免疫后的第七天采血，通过Western-blot检测anti-rClpC2抗血清的特异性；双向免疫扩散法和间接ELISA检测anti-rClpC2抗血清的效价；rClpC2通过间接ELISA进行抗原性的初步检测，anti-rClpC2抗血清通过间接ELISA检测肺结核病人血清中ClpC2抗原，判断rClpC2和兔抗ClpC2多克隆抗体分别作为检测抗原或抗体的特异性和敏感性。 3.通过检测各组菌液OD600观察过表达ClpC2或ClpP1蛋白及共表达ClpP1和ClpC2蛋白的E.coli BL21的生长曲线及其在氧化应激、酸应激、碱应激、乙醇应激条件下的生长状况；采用结晶紫半定量法检测蛋白过表达对E.coli BL21生物膜形成的影响。 结果 1.重组原核表达质粒pET32a(+)/ClpC2双向测序结果显示与ClpC2基因序列完全一致，表达的融合蛋白Trx-ClpC2相对分子质量为46000，可与MTB H37Rv株免疫的小鼠血清发生抗原抗体反应。 2.纯化的rClpC2纯度约为88.5%，Western-blot验证anti-rClpC2抗血清的特异性；ELISA测得anti-rClpC2抗血清的效价为1:320000，双向免疫扩散法测得anti-rClpC2抗血清的效价为1:32；rClpC2在检测肺结核病人中的相应抗体检出率为46%，检测敏感性为46%，特异性为90%；anti-rClpC2抗血清在检测肺结核病人中的相应抗原检出率为40%，检测的敏感性为40%，特异性为90%。 3.过表达ClpP1蛋白的E.coli BL21对过氧化氢的耐受增加，共表达ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21的生长；共表达ClpP1和ClpC2蛋白有助于E.coli BL21抵抗酸应激、碱应激；重组蛋白的过表达并未对E.coli BL21生物膜的形成起促进作用。 结论 1.成功构建重组原核表达质粒pET32a(+)/ClpC2，并在E.coli BL21中表达ClpC2蛋白。 2.成功制备兔抗ClpC2多克隆抗体，并初步应用于MTB感染的诊断。 3.ClpP1蛋白与E.coli抵抗氧化应激有关；共表达ClpC2和ClpP1蛋白与E.coli抵抗酸应激、碱应激有关。
【关键词】：结核分枝杆菌 ClpC2 抗血清 应激反应
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-14
• 前言14-16
• 第一部分 结核分枝杆菌 ClpC2 基因原核表达质粒的构建、表达及鉴定16-29
• 1 材料与方法16-24
• 2 实验结果24-27
• 3 讨论27-29
• 第二部分 结核分枝杆菌 ClpC2 蛋白的纯化、抗血清的制备及抗原性分析29-38
• 1 材料与方法29-33
• 2 实验结果33-36
• 3 讨论36-38
• 第三部分 蛋白过表达对大肠杆菌的影响38-47
• 1 材料与方法38-41
• 2 实验结果41-45
• 3 讨论45-47
• 全文小结47-48
• 参考文献48-53
• 文献综述53-63
• 参考文献58-63
• 致谢63-64
• 攻读硕士学位期间发表的学位论文64-65

【参考文献】

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1 牛钦王;李红霞;曾林子;徐佳楠;陈建平;;结核分枝杆菌三种特异性抗体ELISA检测方法的建立[J];热带医学杂志;2010年10期

2 董江涛;徐芳;田玺择;姚楠;吴芳;章乐;王远志;曹旭东;张万江;;不同毒力结核分枝杆菌感染小鼠对肺泡巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化的影响[J];中国免疫学杂志;2012年05期

本文编号：703480