免疫磁珠分离技术用于弓形虫速殖子纯化的研究

发布时间：2017-08-20 04:21

  本文关键词：免疫磁珠分离技术用于弓形虫速殖子纯化的研究

  更多相关文章： 弓形虫 纯化 速殖子 免疫磁珠分离

【摘要】：目的在弓形虫和弓形虫病的基础和临床研究中，以及免疫诊断的抗原制备中，如何从弓形虫感染的宿主标本中快速获得高度纯化的弓形虫速殖子，尽可能去除宿主细胞成分的污染，又尽可能避免对虫体产生机械或者化学的损伤，不影响其活性与毒力显得尤为重要。目前使用的各种方法纯化产物尚有不同程度的宿主细胞的污染，或者回收率较低。因此，需要探讨一种新的纯化弓形虫速殖子的方法。用免疫磁珠分离技术分选弓形虫速殖子，，以去除宿主细胞成分，并尽可能对虫体的生物学特性无不良影响，为弓形虫与弓形虫病的基础与临床研究提供技术基础。 方法将采自流浪猫的心、脑、舌组织提取的弓形虫Wh3株速殖子（基因型为China1）感染小鼠，发病后提取腹腔液，无菌生理盐水离心洗涤三次后，常规方法制备速殖子可溶性抗原, BCA蛋白浓度测定法测定抗原浓度。免疫新西兰大白兔共3次，获得兔抗弓形虫多克隆抗体IgG。用弓形虫IHA间接血凝诊断试剂测定抗体效价，Protein A Sepharose CL-4B亲和层析柱纯化抗体后进行SDS-PAGE电泳鉴定抗体的纯度。用抗体包被的免疫磁珠Goat Anti-Rabbit IgG MicroBeads对小鼠腹腔液内弓形虫速殖子进行纯化，按照说明书操作并稍加改进，比较速殖子纯度、细胞清除率、虫体回收率，并进行染色镜检。用MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒进行速殖子活性检测，用酶标仪测定490nm波长各孔吸光度值。将速殖子悬液定量分组感染小鼠后，检测其毒力与感染性。 结果BCA法测定抗原浓度为0.7mg/ml，纯化后IgG抗体轻链和重链分子量在25ku和50ku。用免疫磁珠分离技术纯化弓形虫速殖子后，其纯度提高到98.2%，弓形虫速殖子与小鼠细胞数量之比为53.6:1，细胞清除率为96%，虫体回收率为73.5%。磁珠分离前后速殖子及小鼠细胞瑞氏染色镜检，磁珠分离前腹腔液涂片可见速殖子和少量小鼠细胞，分离后悬液涂片可见大量速殖子，视野中小鼠细胞比例明显减少。速殖子MTS细胞增殖与毒性检测试剂盒活性检测为95.6%，磁珠分离前后速殖子活性检测吸光度值差异无统计学意义，说明磁珠分选对弓形虫速殖子活性无明显影响。定量分组感染小鼠后死亡时间无显著性差异，死亡前均出现弓形虫急性感染的临床体征，腹水可见大量的弓形虫速殖子和假包囊，说明磁珠分选对弓形虫速殖子毒力无影响。 结论免疫磁珠分离后的速殖子纯度、细胞清除率和虫体回收率较高，能有效的去除宿主细胞，且对速殖子的活性和毒力无影响。分离后速殖子镜检形态典型完整。本法操作简便快速，无需昂贵的仪器设备，具有较大的实用价值。
【关键词】：弓形虫 纯化 速殖子 免疫磁珠分离
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R382.5
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-26
• 实验材料和试剂13-17
• 实验方法17-26
• 统计学处理26
• 结果26-31
• 讨论31-34
• 结论34-35
• 参考文献35-40
• 附录一 个人简历40-41
• 附录二 致谢41-42
• 附录三 综述42-51
• 参考文献48-51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 杨万;何苗;;免疫磁珠分离技术在环境病原微生物检测中的应用[J];安全与环境学报;2008年06期

2 沈继龙,徐贞光;病鼠腹腔液内弓形虫速殖子的分离[J];蚌埠医学院学报;1983年03期

3 廖力，吴伟，程道新;4种提纯弓形虫速殖子方法的比较研究[J];衡阳医学院学报;1995年04期

4 石淙;万腊根;;细胞增殖的检测方法[J];实验与检验医学;2012年02期

5 于露;孙秀兰;;免疫磁珠技术研究进展[J];粮食与油脂;2011年10期

6 徐亮,曾明安;4℃冰箱冷藏保存弓形虫速殖子的可行性观察[J];实用寄生虫病杂志;2001年03期

7 熊齐荣;牛瑞江;解泉源;熊勇华;赖卫华;;磁珠离子交换吸附法纯化兔血清中多克隆抗体的研究[J];食品科学;2011年13期

8 何小曼;曾繁启;;免疫磁珠分离技术在微生物学检测中的应用[J];中国生物制品学杂志;2008年11期

9 刘佩梅，吴增强，武苏平;弓形虫速殖子纯化方法的比较[J];天津医科大学学报;1996年01期

10 俞乃勋,陈金伟,金柏新,吴硕显;制备间接血凝试验抗原用弓形虫速殖子的净化[J];微生物学通报;1983年04期

本文编号：704601