副溶血性弧菌免疫检测新方法研究

发布时间：2017-08-20 05:20

  本文关键词：副溶血性弧菌免疫检测新方法研究

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【摘要】：食源性疾病是目前世界上最为常见、分布最广的疾病之一，，由致病菌所引起的食源性疾病在国内外都是极为重要的公共卫生安全问题。随着经济发展，近年来我国各地区尤其是沿海地区因食用副溶血性弧菌污染的水产品所引起的食物中毒已经高居微生物性食物中毒的首位。目前已报道的副溶血性弧菌检测方法均各有其优缺点，因此有必要不断探索研发操作更为便捷、检测更为快速、灵敏度更高的新型检测方法。本课题对目前广泛应用的免疫学检测方法进行了改进，制备、评价了针对副溶血性弧菌表面蛋白的三种抗体探针，并结合磁分离富集技术和稀土上转换发光纳米探针技术，建立了针对副溶血性弧菌的新型免疫检测方法。 本文首先通过基因工程方法，扩增得到了副溶血性弧菌鞭毛蛋白FlaA、外膜蛋白OmpU和OmpW的对应编码基因，分别克隆到pET28a、pET24a质粒载体上。将构建成功的重组表达载体pET28a-FlaA、pET24a-OmpW、pET24a-OmpU转化入表达宿主菌E.coli BL21（DE3）。然后对表达宿主菌进行IPTG诱导表达，并用Ni-NTA resin柱对三种目标蛋白进行了纯化，经SDS-PAGE电泳验证得到了单一条带的抗原蛋白。 其次，分别以副溶血性弧菌灭活菌体、纯化的FlaA、OmpU和OmpW蛋白作为抗原对家兔进行免疫，制备多克隆抗血清，并经饱和硫酸铵分级沉淀法纯化获得多克隆抗体。得到纯化后效价为1:160,000的全菌抗体；针对全菌抗原效价为1:16000的FlaA抗体、效价为1:16,000的OmpU抗体、效价为1:8,000的OmpW抗体。用流式细胞术对四种抗体的特异性进一步量化评估，全菌抗体与副溶血性弧菌的结合率为91.57±5.40%；FlaA抗体为89.77±6.89%；OmpU抗体为34.32±2.78%；OmpW抗体为63.53±5.40%。由此选择全菌抗体、FlaA抗体进行后续实验方法的建立。 随后，采用水热-溶剂热方法成功制备了氨基化磁性纳米粒子，在最佳初始抗体溶液浓度600μg/mL、反应40min条件下将其与全菌抗体组装成免疫磁珠。同时采用水热法制备得到了具有稳定、灵敏、可避免生物样本自发荧光干扰等优点的稀土上转换发光纳米粒子NaYF_4:Yb,Er，在最佳初始抗体溶液浓度800μg/mL、反应60min条件下将其与FlaA抗体组装成信号探针。然后将磁珠-全菌抗体与目标菌孵育，外加磁场分离后再与UCNPs-FlaA抗体孵育，形成“三明治”夹心型复合体，980nm激发测定其特征荧光峰强度。结果显示，在5×10~3-5×10~5cfu/mL范围内，副溶血性弧菌菌落数与荧光强度呈现良好的线性关系，线性回归方程为Y=178.25X-506.41（R2=0.9919），检出限为10~3cfu/mL。在模拟水产品样品的检测中，加标回收率为90.7%-96.7%，与传统的平板计数法结果一致。
【关键词】：副溶血性弧菌 抗体 免疫分析 磁性纳米粒子 稀土上转换发光纳米粒子
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 引言9-16
• 1.1 副溶血性弧菌检测的意义与方法9-12
• 1.1.1 副溶血性弧菌检测的意义9-10
• 1.1.2 副溶血性弧菌的检测方法10-12
• 1.2 副溶血性弧菌外膜蛋白的研究进展12-13
• 1.3 稀土上转换发光纳米材料的研究与应用13-14
• 1.4 论文的立题意义与研究内容14-16
• 1.4.1 论文立题意义14
• 1.4.2 论文主要研究内容14-16
• 第二章 实验材料与方法16-29
• 2.1 材料与主要试剂16-17
• 2.1.1 菌株、质粒和实验动物16
• 2.1.2 主要试剂与工具酶16
• 2.1.3 主要溶液的配制16-17
• 2.1.4 主要仪器17
• 2.3 实验原理17-19
• 2.3.1 抗体与氨基化磁珠连接原理17-18
• 2.3.2 基于磁分离、上转换材料发光的 V. parahaemolyticus 检测方法原理18-19
• 2.4 实验方法19-29
• 2.4.1 菌株的活化与培养鉴定19
• 2.4.2 重组表达载体的构建19-21
• 2.4.3 外源蛋白表达与纯化21-23
• 2.4.4 动物免疫及抗血清制备23-24
• 2.4.5 间接 ELISA 法评价抗体24-25
• 2.4.6 免疫磁珠的制备25-26
• 2.4.7 抗体的稀土发光上转换纳米粒子标记26-27
• 2.4.8 基于磁分离、上转换荧光标记的副溶血性弧菌检测方法的建立27
• 2.4.9 模拟水产样品中副溶血性弧菌的检测27-29
• 第三章 结果与讨论29-51
• 3.1 副溶血性弧菌 ATCC 17802 菌株的复苏及革兰氏染色镜检29
• 3.2 重组表达载体 pET28a-FlaA、pET24a-OmpU，pET24a-OmpW 的构建29-30
• 3.3 目标蛋白的表达与纯化30-33
• 3.3.1 FlaA 蛋白的表达与纯化30-31
• 3.3.2 OmpW 蛋白的表达与纯化31-32
• 3.3.3 OmpU 蛋白的表达与纯化32-33
• 3.4 抗体纯化33-34
• 3.5 抗体纯化前后效价测定34-36
• 3.5.1 全菌抗体效价34-35
• 3.5.2 FlaA 抗体效价35
• 3.5.3 OmpU 抗体效价35
• 3.5.4 OmpW 抗体效价35-36
• 3.6 抗体针对全菌抗原效价测定36
• 3.7 棋盘滴定法确定抗体、抗原最适工作浓度36-38
• 3.7.1 全菌抗体及 V. parahaemolyticus 抗原最适工作浓度36-37
• 3.7.2 FlaA 抗体及 V. parahaemolyticus 抗原最适工作浓度37
• 3.7.3 OmpU 抗体及 V. parahaemolyticus 抗原最适工作浓度37-38
• 3.7.4 OmpW 抗体及 V. parahaemolyticus 抗原最适工作38
• 3.8 抗体浓度测定38
• 3.9 敏感性试验38-39
• 3.9.1 全菌抗体敏感性实验38
• 3.9.2 FlaA 抗体敏感性实验38-39
• 3.9.3 OmpU 抗体敏感性实验39
• 3.9.4 OmpW 抗体敏感性实验39
• 3.10 抗体特异性实验39-41
• 3.10.1 全菌抗体特异性实验39-40
• 3.10.2 FlaA 抗体特异性实验40
• 3.10.3 OmpU 抗体特异性实验40
• 3.10.4 OmpW 抗体特异性实验40-41
• 3.11 流式细胞术评价抗体特异性41-43
• 3.11.1 全菌抗体特异性评价41
• 3.11.2 FlaA 抗体特异性评价41-42
• 3.11.3 OmpU 抗体特异性评价42
• 3.11.4 OmpW 抗体特异性评价42-43
• 3.12 磁珠与全菌抗体的结合与表征43-46
• 3.12.1 氨基化磁珠的表征43-44
• 3.12.2 氨基化磁珠与全菌抗体结合的表征44-45
• 3.12.3 孵育时间的优化45
• 3.12.4 全菌抗体初始浓度的优化45-46
• 3.13 氨基化 UCNPs 与 FlaA 抗体的结合与表征46-49
• 3.13.1 UCNPs 的表征46-47
• 3.13.2 氨基化 UCNPs 的表征47-48
• 3.13.3 氨基化 UCNPs 与 FlaA 抗体结合的表征48-49
• 3.13.4 孵育时间的优化49
• 3.13.5 FlaA 抗体初始浓度的优化49
• 3.14 副溶血性弧菌的检测49-50
• 3.15 模拟水产品中副溶血性弧菌的检测50-51
• 主要结论与展望51-52
• 致谢52-53
• 参考文献53-58
• 附录58

【参考文献】

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本文编号：704816