人CD137和CD28蛋白表达及单克隆抗体制备

发布时间：2017-08-20 12:12

  本文关键词：人CD137和CD28蛋白表达及单克隆抗体制备

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【摘要】：目的：真核表达人CD137和CD28-免疫球蛋白融合蛋白,分别制备CD137和CD28单克隆抗体,为淋巴细胞活化及其应用奠定基础。 内容：1.CD137/CD28真核表达载体的构建；2.瞬时、稳定表达CD137和CD28融合蛋白细胞株建立、蛋白制备及其鉴定；3.CD137和CD28单克隆抗体制备。 方法：淋巴细胞分离液分离人外周血单个核细胞、经过PHA体外刺激培养，收集细胞提取总RNA，反转录聚合酶链反应（RT-PCR）扩增CD137及CD28胞外区全长序列，构建pD18Y-CD137和pD18Y-CD28的表达载体，同时构建pCDH-CD137和pCDH-CD28的表达载体。利用Lipofectamine2000瞬时转染COS-7细胞，经ELISA和Western blot鉴定培养上清融合蛋白表达情况。稳定转染中国仓鼠卵巢细胞CHO/dhfr-，利用二氢叶酸还原酶基因选择系统，以透析血清及甲氨蝶呤MTX加压筛选分别获得持续表达pD18Y-CD137-Ig、pD18Y-CD28-Ig工程株。采用双抗夹心ELISA和免疫印迹实验对上述融合蛋白进行定性和定量，流式检测hIg-CD28表达蛋白活性，通过亲和层析富集表达上清融合蛋白。采用常规免疫方法免疫BALB/c小鼠，进行细胞融合实验。利用有限稀释法和反复克隆获取稳定杂交瘤。 结果：顺利实现了pCDH-CD137/CD28和pD18Y-CD137/CD28表达载体构建；获得了分别表达pD18Y-CD137/CD28-Ig和pCDH-CD137/CD28-Ig融合蛋白的转染表达细胞株，瞬时或稳定表达目的融合蛋白。体外活性分析证实hIg-CD28融合蛋白具有体外与天然配体结合活性，，与活化B淋巴细胞结合；经过筛选和克隆，获得了至少5株CD137单克隆抗体；CD28杂交瘤细胞株初筛出25株阳性克隆。 结论：真核系统成功表达人CD137和CD28免疫球蛋白融合蛋白，成功制备了CD137和CD28单克隆抗体，能够与CD137和CD28蛋白高亲和力结合，为后续相关基础及应用研究奠定了基础。
【关键词】：人CD137 人CD28 融合蛋白表达 单克隆抗体制备
【学位授予单位】：北京市结核病胸部肿瘤研究所
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 缩略词表4-6
• 摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-10
• 第一部分 CD137 及 CD28 真核表达载体构建10-23
• 材料和方法10-19
• 结果19-23
• 第二部分 融合蛋白的表达、鉴定23-42
• 材料和方法23-33
• 结果33-42
• 第三部分 CD137 和 CD28 特异性单克隆抗体制备42-55
• 材料和方法42-50
• 结果50-55
• 讨论55-59
• 结论59-60
• 参考文献60-63
• 文献综述63-73
• 参考文献70-73
• 攻读学位期间发表论文情况73-74
• 致谢74-75
• 个人简历75

【共引文献】

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本文编号：706543