广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型制作的初步研究

发布时间：2017-08-20 11:23

  本文关键词：广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型制作的初步研究

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【摘要】：动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种由遗传和环境共同作用所引起的动脉血管疾病,是心脑血管疾病发病的基础。其主要特征是血管内膜增厚,管腔变狭窄,不稳定的纤维帽破裂,形成急性血栓。动脉粥样硬化的致病机制尚不是很清楚,制作动物模型研究其发生发展机制显得尤为重要。小型猪在解剖学,生理学,血液和血液生化指标以及疾病发生机理等方面与人极其相似,常被用于制作心脑血管疾病和糖尿病等方面的动物模型。本实验以广西巴马小型猪为实验材料,选取糖尿病模型猪10头,常规条件饲养的3月龄和6月龄猪各10头,分别作为实验组1,实验组2和实验组3,饲以高脂高胆固醇饲料；选取6月龄猪10头作为对照组并按常规条件进行饲养。 在饲喂高脂高胆固醇饲料三个月后,实验组1动物出现高胆固醇血症,动脉粥样硬化指数(atherosclerosis index, AI)均大于4.0,血管切片显示血管内膜均出现不同程度的损伤,腹主动脉和冠状动脉出现明显的内膜增厚,纤维斑块隆起,血管腔变窄；HE染色结果显示病灶处平滑肌细胞排列疏松紊乱,并存在大量的炎症细胞和泡沫细胞,伴随有典型的胆固醇结晶和斑块底部钙化,最严重的可达V级病变。 实验组2和实验3组饲喂高脂高胆固醇饲料后,体重增加明显,实验开始第5个月,实验组2有4头猪AI值连续3个月超过3.8；实验组3实验开始第2个月和第3个月各有1头猪AI值连续3个月超过3.8。实验组3饲喂3个月,6个月后各屠宰3头,做血管组织切片,HE染色结果显示已发病猪的血管内膜损伤,有明显的纤维斑块隆起,中层平滑肌细胞紊乱,有散在的炎症细胞和泡沫细胞,胆固醇结晶和钙化不明显,纤维病变可达Ⅱ级或Ⅲ级。 将建模成功的猪的切片与AI值做关联分析,初步确定广西巴马小型猪AS模型成功建立的判定标准为：实验猪发生AS疾病时,AI值应持续3个月或3个月以上大于3.8。实验组1所有猪的AI值都远远高于3.8,且持续3个月以上,表明都已患动脉粥样硬化疾病；实验组2和实验组3发生AS疾病的猪分别有2和4头。 克隆广西巴马小型猪单核细胞趋化蛋白-1基因编码区全长,将克隆获得的片段与NCBI上公布的猪的MCP-1序列比对,没有发现突变位点。其长度为300bp,与人的同源性为84.4%,与兔和小鼠的同源性分别为82.1%和74.2%。广西巴马小型猪MCP-1基因保守的半胱氨酸位置和人的一致,推测与人的MCP-1可能有相同或相似的二级结构。 对实验组3和对照组的单核细胞趋化蛋白-1和基质金属蛋白酶-9的转录水平和翻译水平的表达量进行研究。免疫组化结果显示,实验组3中MCP-1蛋白,MMP-9蛋白和LOX-1蛋白均有强阳性表达,对照组无表达或弱表达。实时定量PCR结果显示：实验组3与对照组比较,MCP-1基因表达量随时间延长而增高,颈动脉处MCP-1基因表达量具有显著性差异(p0.05)；但两组小型猪的MMP-9基因表达水平差异不显著(p0.05)。
【关键词】：广西巴马小型猪 动脉粥样硬化模型 单核细胞趋化蛋白-1 基质金属蛋白酶-9 免疫组化 实时定量PCR
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R543.5;R-332
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 文献综述13-20
• 1 动脉粥样硬化13-15
• 1.1 动脉粥样硬化简介13
• 1.2 动脉粥样硬化易患部位13
• 1.3 动脉粥样硬化致病机理13-14
• 1.4 动脉粥样硬化致病因素14-15
• 2 动脉粥样硬化动物模型研究的进展15-16
• 3 动脉粥样硬化相关基因的研究进展16-19
• 3.1 单核细胞趋化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)16-17
• 3.2 基质金属蛋白酶9(Matrix metalloproteinases 9,MMP-9)17-19
• 4 本研究的目的和意义19-20
• 第二章 实验研究20-23
• 1. 实验材料20-22
• 1.1 材料来源20
• 1.2 主要试剂与酶类20
• 1.3 抗体来源20-21
• 1.4 溶液试剂及培养基的配置21-22
• 2. 实验仪器22-23
• 实验一 广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型的制作23-38
• 1. 方法23-25
• 1.1 实验动物的选择23
• 1.2 动脉粥样硬化模型的制作23-24
• 1.3 血管组织切片的制作24-25
• 1.4 数据处理25
• 2. 结果25-35
• 2.1 体重变化25-26
• 2.2 血液生化指标及AI值26-29
• 2.3 个体动脉粥样硬化病理切片及其与个体AI指数值的关联分析29-35
• 3 讨论35-38
• 实验二 广西巴马小型猪MCP-1的克隆及分析38-47
• 1 实验材料38
• 2 实验方法38-42
• 2.1 总RNA的提取38
• 2.2 反转录38-39
• 2.3 引物设计39-40
• 2.4 目的片段合成40
• 2.5 PCR产物纯化回收40-41
• 2.6 目的片段与PMD-18T载体的连接41
• 2.7 重组质粒转化感受态细菌及阳性质粒筛选41-42
• 2.8 广西巴马小型猪MCP-1蛋白预测42
• 3 结果与分析42-45
• 3.1 总RNA的提取42
• 3.2 MCP-1基因PCR扩增电泳及菌液PCR电泳42-43
• 3.3 MCP-1基因目的片段测序结果43-44
• 3.4 广西巴马小型猪MCP-1蛋白一级结构44
• 3.5 广西巴马小型猪MCP-1蛋白预测44-45
• 4 讨论45-47
• 实验三 广西巴马小型猪AS相关基因的表达检测47-65
• 1. 实验材料47
• 2. 实验方法47-51
• 2.1 免疫组化切片的制作47
• 2.2 免疫组化阳性率统计47-48
• 2.3 血管及肝脏组织RNA的提取48
• 2.4 反转录48-49
• 2.5 引物设计与合成49
• 2.6 MMP-9,MCP-1和内参18s的标准曲线的建立49-50
• 2.7 MMP-9基因和MCP-1基因相对表达量50
• 2.8 数据统计分析50-51
• 3 结果51-61
• 3.1 实验组3和对照组免疫组化结果51-57
• 3.2 RNA完整性检测57
• 3.3 MMP-9,MCP-1和18s基因标准曲线的建立结果57-58
• 3.4 MCP-1和MMP-9的相对表达结果58-61
• 4 讨论61-65
• 4.1 实验组3和对照组免疫组化61-62
• 4.2 实时荧光定量PCR62
• 4.3 MCP-1与MMP-9基因表达分析62-65
• 结论65-67
• 参考文献67-71
• 致谢71-73
• 攻读硕士学位期间发表论文情况73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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本文编号：706348