吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立及中药的干预机制

发布时间：2017-08-20 17:16

  本文关键词：吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立及中药的干预机制

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【摘要】：研究背景 药物依赖一直以来都是全球广泛关注的一个话题,药物的滥用和毒品的广泛传播是导致药物依赖的主要原因。目前,阿片类药物是全球滥用情况最严重的药物之一,该药物滥用问题已成为一个世界公共卫生和社会问题。阿片类药物不仅能使人产生强烈的欣快感,同时还能有效的抑制呼吸、咳嗽中枢并具有兴奋神经中枢作用,而最令人头疼不已的是,阿片类成瘾后即使戒断,仍存在难以控制的戒断反应,造成吸食者出现不断的复吸,因此全球每年都有几十万人至几百万人因为吸食阿片类毒品而死亡。 现阶段针对阿片类药物成瘾的治疗方式主要有美沙酮、丁丙诺啡等的替代治疗及α2受体激动剂及镇静催眠类药物的非替代治疗,而中草药治疗作为一种非替代治疗方式,因其具有撤出容易,本身无成瘾性的优势,逐渐在成瘾治疗方面发挥重要作用。 大量研究表明,阿片类药物成瘾及戒断与阿片受体、谷氨酸受体及多巴胺受体的调控密切相关。μ阿片受体和δ阿片受体能共同介导阿片系统的奖赏效应,诱导动物产生条件性位置偏爱(CPP)行为。通过阻断多巴胺受体限速酶TH和NMDA受体在动物脑内的传递能改变阿片类药物引起的动物行为学的变化。因此,研究阿片类成瘾动物脑内阿片受体、谷氨酸受体及多巴胺受体的变化及变化趋势能够更深入的了解阿片类药物成瘾机制,为寻找阿片类戒断药物提供方向和依据。 目前判断动物成瘾的主要指标是观察其行为学上表现是否发生变化,条件性位置偏爱模型(CPP)是目前测定动物奖赏效应的最有效手段之一,也是评价药物精神依赖的有效方法。然而,目前国内利用CPP进行药物依赖的研究主要集中在大小鼠等啮齿动物模型,而少有利用其它模型来进行药物依赖研究的报道。而单一的动物模型往往不足以证明药物的确切效果,在研究过程中存在很大的局限性。因此,我们亟待寻找一种新的模型生物,并将其引入药物依赖研究领域,为将来成瘾治疗药物筛选提供多模型的支持。 斑马鱼(Danio rerio, zebrafish)是一种常见的热带观赏鱼,因其生长周期短,胚胎发育透明,产卵量多,易于饲养等众多优势被应用于医学研究。近年来,斑马鱼也越来越多的被应用于行为学研究领域,有研究表明,斑马鱼脑内也存在与啮齿动物相似的阿片受体及谷氨酸受体、多巴胺受体等,因此,利用斑马鱼动物模型进行阿片类药物依赖的研究具有极大的可行性。 实验目的 1.建立吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型,并对模型进行验证。在模型建立成功后,利用中药有效成分对吗啡依赖的斑马鱼进行干预,观察药物干预后斑马鱼行为学的变化。 2.采用q-PCR的方法,检测吗啡诱导的斑马鱼脑内阿片受体水平的变化,并观察中药干预后,斑马鱼脑内相关受体水平的变化。 3.采用免疫组化的方法,检测吗啡诱导的斑马鱼脑内TH和NR2B受体表达的变化,并观察中药干预后,相关受体表达水平是否发生改变。 4.利用斑马鱼胚胎验证中药有效成分青藤碱及阳性药美沙酮是否具有胚胎毒性,为青藤碱应用于临床戒毒提供毒理学的依据。 实验方法 1.吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立 自制CPP鱼缸(一缸为透明,一缸为褐色),褐色箱体部分为斑马鱼的偏爱箱,透明箱体部分为非偏爱箱(伴药箱)。取基线测定合格(斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间≥8min)的斑马鱼60条,称重,随机分为生理盐水组,30、40、50、60、90μg·g-1吗啡模型组,每组10条,雌雄各半。于正式实验d1测定斑马鱼15min内在CPP箱透明侧(非偏爱箱)的活动时间,并用Noldus EthoVisionXT8.5软件追踪斑马鱼在CPP箱中的运动轨迹(5min)。于实验d2、d4、d6斑马鱼腹腔注射各浓度吗啡(空白组注射生理盐水),将其放入伴药箱内40min。d3、d5同一时间斑马鱼腹腔注射与吗啡同体积生理盐水,将其放入偏爱箱内40min。在末次给药24h后即d7再次测定斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间并比较训练前后各条斑马鱼在伴药箱活动时间的差值,并分析斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹及运动总路程。 2.中药有效成分青藤碱对吗啡诱导的斑马鱼药物依赖的干预 取基线测定合格的斑马鱼50条,称重,随机分为生理盐水组,吗啡模型组,吗啡+美沙酮组(40μg-g-1),吗啡+青藤碱低剂量组(40μg·g-1),吗啡+青藤碱高剂量组(80μg-g-1),每组10条,雌雄各半。给药方法同造模给药。于每日造模给药12h后,青藤碱高低剂量组和美沙酮给药组斑马鱼分别注射各浓度药物,生理盐水组和模型组注射同体积生理盐水。末次给药12h后即d7再次测定斑马鱼在非偏爱箱中的活动时间并比较训练前后各条斑马鱼在伴药箱活动时间的差值,同时分析斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹及运动总路程。 3.青藤碱对吗啡依赖斑马鱼脑内阿片受体和TH、NR2B表达的影响 各组斑马鱼行为学指标检测结束后,斑马鱼迅速冷冻处死,显微镜下取脑组织。采用q-PCR技术检测各组斑马鱼脑组织中zfinor、zfdor1、zfdor2mRNA的表达；免疫组化方法检测各组斑马鱼脑内TH和NR2B受体的表达。 4.青藤碱及美沙酮对斑马鱼胚胎的心脏毒性研究 收集斑马鱼胚胎,孵育48h。将48hpf的胚胎随机分组放入24孔板中,每孔8枚胚胎。按预实验结果设定青藤碱1000、500、300、200、100mg/L浓度组和美沙酮1000、500、300、200、100mg/L浓度组以及胚胎培养液空白对照组,每组取24孔板两孔共16枚胚胎。按上述浓度进行给药后12h和24h体式显微镜下观察各组胚胎心包及心脏形态,并记录其心率。整个实验重复进行3次,每次实验用同一批斑马鱼胚胎。 5.统计方法 统计结果均采用x±s的形式表示,采用spss17.0统计学软件进行处理,多组间数据比较采用单因素方差分析,方差齐时用LSD法,方差不齐时采用Dunnett's T3进行检验,同组数据比较用配对样本t检验。以P0.05表示有统计学差异。 实验结果 1.以腹腔注射给药的方式,各组斑马鱼训练之前在伴药箱的活动时间无明显差异(P0.05),而注射吗啡并进行连续3次训练后,40、50、60μg·g-1吗啡组斑马鱼在伴药箱中的活动时间比训练前均明显增加(P0.05),而40、50gg·g-1吗啡组斑马鱼在伴药箱活动时间的差值与生理盐水组比较有显著差异(P0.01)。比较斑马鱼5min内在伴药箱中的运动总路程,各组斑马鱼训练前在伴药箱中的运动路程无明显差异,而训练后,40、50gg·g-1吗啡组斑马鱼在伴药箱中的总路程明显延长(P0.01),表明腹腔注射40-50gg·g-1吗啡并对斑马鱼进行连续3次训练能够诱导其条件性位置偏爱的形成。记录斑马鱼在CPP箱中的运动轨迹,注射40μg·g-1吗啡后斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹明显增多,而空白组斑马鱼在非偏爱箱中的运动轨迹训练前后无明显变化。 2.青藤碱干预吗啡依赖的斑马鱼后,40μg·g-1吗啡模型组斑马鱼造模前后在伴药箱中的活动时间差值与空白组相比,差异具有显著性意义(P0.05)。而青藤碱高剂量(80μg·g-1)组和美沙酮(40μg·g-1)组训练前后在伴药箱中的活动时间的差值与模型组相比有显著性差异；与空白组相比,差异无显著性意义。 3. q-PCR结果发现,模型组斑马鱼脑内μ阿片受体(zfmor)和6阿片受体(zfdorl和zfdor2)的相对表达量,与空白组相比,均显著降低(P0.05),表明连续注射吗啡能抑制斑马鱼脑内阿片受体的表达。而注射给予斑马鱼美沙酮或不同剂量青藤碱后,发现80μg·g-1的青藤碱能使斑马鱼脑内zfmor、zfdor1、 zfdor2的表达均上调,与吗啡模型组相比,差异具有统计学意义(P0.01),而40μg·g-1的青藤碱能使zfmor的表达上调,恢复成正常水平,但zfdorl和zfdor2的表达与模型组相比,无显著性差异。 4.免疫组化结果表明,模型组斑马鱼脑内TH和NR2B蛋白的表达与空白组相比显著增加,提示吗啡通过调控斑马鱼脑内TH和NR2B的水平来诱导成瘾。80μg·g-1的青藤碱和美沙酮干预后,斑马鱼脑内TH和NR2B表达显著降低,表明青藤碱可能通过抑制斑马鱼脑内部分谷氨酸受体及多巴胺受体的表达来抑制成瘾。 5.利用系列剂量美沙酮处理48hdf斑马鱼胚胎后,1000mg/L、500mg/L组斑马鱼胚胎在给药12h后全部死亡,而300mg/L、200mg/L斑马鱼胚胎也出现部分死亡,存活斑马鱼给药12h、24h后心率与空白组相比,均显著降低。100mg/L美沙酮处理40hdf斑马鱼胚胎后,未出现死亡,心率与空白组相比,也无显著性差异。系列剂量青藤碱处理48hdf斑马鱼胚胎,结果各剂量组斑马鱼胚胎在给药后12h、24h心率与空白组相比,差异均无显著性意义,斑马鱼心脏区域也未出现心包肿大、心区淤血堆积等现象,该结果表明青藤碱对斑马鱼心脏无明显毒性。 结论 1.本研究中斑马鱼经过连续3次注射吗啡(40-50μg·g-1),其训练前后在伴药箱中的活动差值及运动路程、运动轨迹与空白组相比均明显增多,表明吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型构建成功,也证明斑马鱼能够成功用于药物依赖方面的研究。 2.青藤碱高剂量组(80μg·g-1)和美沙酮(40μg·g1)干预均能抑制吗啡诱导的条件性位置偏爱,使斑马鱼在伴药箱中停留时间显著降低,表明美沙酮和高剂量的青藤碱均能有效抑制吗啡依赖引起的斑马鱼行为学的变化。而低剂量(40μg·g-1)的青藤碱不能引起吗啡依赖斑马鱼行为的显著变化。 3.连续3次注射吗啡能使斑马鱼脑内zfinor、zfdor1、zfdor2的表达下调,而青藤碱高剂量(80μg·g-1)和美沙酮(40μg·g-1)的干预能抑制吗啡依赖引起的zfinor、zfdor1、zfdor2表达下调,但是低剂量的青藤碱不能产生明显的抑制效果。 4.斑马鱼吗啡依赖也可能与其脑内TH和NR2B的表达改变有关,而青藤碱能够抑制这种改变从而戒断毒瘾。 5.青藤碱各剂量组处48hdf斑马鱼胚胎后,其给药后12h、24h心率与空白组相比,均无显著性变化,表明青藤碱并无明显的斑马鱼胚胎毒性,正常剂量的青藤碱能够运用于吗啡依赖的戒断。
【关键词】：斑马鱼 吗啡 条件性位置偏爱 阿片受体 谷氨酸受体 青藤碱
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R-332;R285.5
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-25
• 第一章 吗啡诱导的斑马鱼条件性位置偏爱模型的建立25-32
• 1.1 实验材料25-26
• 1.2 实验方法26-27
• 1.3 实验结果27-30
• 1.4 讨论30-32
• 第二章 青藤碱对吗啡诱导斑马鱼条件性位置偏爱行为及脑内相关受体表达的影响32-52
• 2.1 实验材料33-34
• 2.2 实验方法34-41
• 2.3 实验结果41-50
• 2.4 讨论50-52
• 第三章 青藤碱和美沙酮对斑马鱼胚胎心脏毒性的初步研究52-57
• 3.1 实验材料52-53
• 3.2 实验方法53
• 3.3 结果53-56
• 3.4 讨论56-57
• 第四章 讨论57-61
• 本课题创新之处61
• 问题与展望61-62
• 参考文献62-70
• 综述70-86
• 参考文献79-86
• 成果86-87
• 致谢87-88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：707861