谷胱甘肽过氧化物酶GPX2对p53的调控及作用机制研究

发布时间：2017-08-20 18:03

  本文关键词：谷胱甘肽过氧化物酶GPX2对p53的调控及作用机制研究

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【摘要】：GPX2(谷胱甘肽过氧化物酶2)是GPX家族成员，是人体中主要的酶类抗氧化分子，研究发现GPX2与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移密切相关。此外，GPX2还具有抗凋亡、抗炎症的功能。p53是重要的肿瘤抑制基因，其编码的蛋白质作为转录因子发挥作用，在细胞生长、分化、增殖、凋亡及维持基因组稳定性等方面起重要调控作用。研究还发现p53也具有促氧化和抗氧化双重活性，调控机体氧化应激反应。实验室利用高通量酵母双杂交发现，GPX2可能与p53存在蛋白质相互作用，但对于两者之间相互作用的分子机制及生物学意义并无任何报道。鉴于GPX2和p53两者均与肿瘤发生发展及氧化应激存在密切联系，我们推测两者相互作用很可能在肿瘤发生发展及氧化应激过程中具有重要生物学意义。 本文首先利用免疫共沉淀和GST-pull down技术，证实GPX2与p53存在相互作用，并确定了两者相互作用结构域。进一步利用荧光素酶报告基因实验发现GPX2可以剂量依赖方式抑制p53转录活性；Realtime PCR及Western Blot方法检测GPX2对p53及其下游靶基因表达的影响，发现过表达GPX2可下调p53及其下游靶基因MDM2、Bax、p21等的表达。对GPX2抑制p53活性的分子机制进行研究发现，GPX2可明显促进p53的降解，降低p53蛋白质稳定性，但泛素化实验表明GPX2对p53泛素化水平无明显影响。对GPX2调控p53的生物学意义进行初步研究发现，HCT116p53+/+细胞中敲低GPX2影响细胞G0/G1期阻滞，而在HCT116p53-/-细胞中敲低GPX2则对细胞周期没有明显影响，表明GPX2以p53依赖的方式影响细胞周期。为进一步研究GPX2生物学功能，我们构建了pCDH-GPX2过表达慢病毒和pSicoR-GPX2干涉慢病毒载体，获得稳定过表达/干涉GPX2的慢病毒。感染GPX2干涉慢病毒的HepG2细胞表现对凋亡的易感性，促凋亡蛋白Bax发生活化，而抗凋亡蛋白Bcl-2则表达下调。 综上，本研究首次发现GPX2是一种新的p53负调控因子，可通过与p53相互作用，，促进p53蛋白质降解，抑制p53转录活性，下调p53下游靶基因，进而参与对细胞周期的调控。此外，成功构建了GPX2过表达和干涉慢病毒，为进一步研究GPX2功能奠定了基础。
【关键词】：谷胱甘肽过氧化物酶2 抑癌基因p53 蛋白质相互作用 肿瘤细胞 细胞周期
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-9
• 前言9-10
• 第一章 文献综述10-20
• 1.1 谷胱甘肽过氧化物酶家族10-15
• 1.2 p53 及其功能介绍15-19
• 1.3 本课题研究意义19-20
• 第二章 GPX2 通过与 p53 相互作用调控其稳定性20-44
• 2.1 材料与方法20-28
• 2.1.1 质粒20
• 2.1.2 细胞20
• 2.1.3 常用试剂及试剂盒20-21
• 2.1.4 主要溶液配制21-22
• 2.1.5 一般细胞培养条件22
• 2.1.6 细胞总蛋白提取22
• 2.1.7 Western Blot22-23
• 2.1.8 Co-IP23-24
• 2.1.9 GST-pull down24-25
• 2.1.10 细胞共定位25
• 2.1.11 荧光素酶报告基因检测25-26
• 2.1.12 细胞总 RNA 提取26
• 2.1.13 RT-PCR26-27
• 2.1.14 Real-time RCR27
• 2.1.15 蛋白稳定性27
• 2.1.16 泛素化实验27
• 2.1.17 细胞周期检测27-28
• 2.1.18 统计学分析28
• 2.2 结果与讨论28-43
• 2.2.1 GPX2 在肿瘤细胞系中的表达28
• 2.2.2 GPX2 与 p53 的相互作用28-30
• 2.2.3 GPX2 与 p53 在细胞核存在共定位30-31
• 2.2.4 GPX2 与 p53 相互作用结构域的确定31-32
• 2.2.5 GPX2 对 p53 及其下游靶基因转录活性的影响32-34
• 2.2.6 过表达 GPX2 下调 p53 下游靶基因的表达水平34-36
• 2.2.7 敲低 GPX2 上调 p53 下游靶基因表达水平36-38
• 2.2.8 过表达 GPX2 对 p53 半衰期的影响38-39
• 2.2.9 干涉 GPX2 对 p53 蛋白半衰期的影响39-40
• 2.2.10 GPX2 对 p53 泛素化水平影响40-41
• 2.2.11 GPX2 以 p53 依赖的方式调控细胞周期41-43
• 2.3 小结43-44
• 第三章 GPX2 慢病毒系统的构建及其细胞效应44-59
• 3.1 材料与方法44-49
• 3.1.1 细胞与菌株44
• 3.1.2 常用试剂及试剂盒44-45
• 3.1.3 主要溶液配制45
• 3.1.4 GPX2 慢病毒过表达载体的构建45-47
• 3.1.4.1 扩增目的片段45
• 3.1.4.2 目的片段回收45-46
• 3.1.4.3 双酶切46
• 3.1.4.4 双酶切产物回收46
• 3.1.4.5 连接46
• 3.1.4.6 转化46
• 3.1.4.7 菌落 PCR46-47
• 3.1.4.8 双酶切鉴定47
• 3.1.4.9 质粒提取47
• 3.1.5 GPX2 慢病毒干涉载体的构建47
• 3.1.6 慢病毒包装47-48
• 3.1.7 流式细胞术测病毒滴度48
• 3.1.8 慢病毒感染效果检测48
• 3.1.9 流式细胞术和 Western blot 检测48-49
• 3.1.10 统计学分析49
• 3.2 结果与讨论49-58
• 3.2.1 GPX2 慢病毒过表达载体的构建和包装49-52
• 3.2.2 GPX2 慢病毒干涉载体的构建和包装52-58
• 3.2.2.1 GPX2 干涉载体的构建和鉴定52-53
• 3.2.2.2 慢病毒包装、纯化、浓缩及滴度测定53-54
• 3.2.2.3 干涉慢病毒 pSicoR-GPX2 的表达鉴定54-56
• 3.2.2.4 敲低 GPX2 的表达对 HepG2 细胞凋亡的影响56-58
• 3.3 小结58-59
• 第四章 结论和展望59-60
• 4.1 结论59
• 4.2 展望59-60
• 参考文献60-66
• 附录66-68
• 发表论文和参加科研情况说明68-69
• 致谢69

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本文编号：708058