uPA和VEGF165单基因真核质粒共转染人脐静脉内皮细胞对细胞增殖的影响

发布时间：2017-08-21 00:13

  本文关键词：uPA和VEGF165单基因真核质粒共转染人脐静脉内皮细胞对细胞增殖的影响

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【摘要】：目的： 构建尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和人血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）单基因真核表达质粒，并将uPA和VEGF165单基因真核表达质粒共转染至人脐静脉内皮细胞（HUVECs），检测其转染后uPA、VEGF165的表达及对细胞增殖的影响。 方法： 1. uPA和VEGF165单基因真核表达质粒的构建：设计带酶切位点的PCR引物以及合成引物；常规培养HUVECs，提取RNA逆转录成cDNA；通过PCR对VEGF165及uPA基因片段扩增并引入新的酶切位点；将其分别定向连入真核表达载体pIRES2-EGFP，构建表达目的基因的单顺反子，并转化至感受态细胞。通过PCR、酶切分析及DNA序列测定鉴定重组质粒pIRES2/EGFP-VEGF165和pIRES2/EGFP-uPA。 2.重组质粒扩增后经脂质体介导体外转染人脐静脉内皮细胞，分组为A组(PBS空白对照)、B（空载质粒pIRES2/EGFP转染阴性对照）、C（pIRES2/EGFP-uPA+pIRES2/EGFP共转染）、D组（pIRES2/EGFP-VEGF165+pIRES2/EGFP共转染）、E组（pIRES2/EGFP-VEGF165+pIRES2/EGFP-uPA共转染）。通过MTT比色法检测各组细胞转染后增殖能力，描画细胞生长曲线，实时荧光定量PCR（QPCR）检测各组细胞uPA及VEGF165mRNA相对含量，Western blot检测uPA及VEGF165的蛋白表达。 结果： 1. pIRES2/EGFP-uPA和鉴定pIRES2/EGFP-VEGF165：重组质粒作XhoI和SalI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳可见VEGF165条带和uPA条带，酶切条带与聚合酶链反应产物电泳带处于相同位置。DNA序列测定证实，目的基因插入片段方向正确，序列无突变。 2.转染pIRES2/EGFP-uPA和pIRES2/EGFP-VEGF165，MTT检测结果提示E组细胞增殖速率高于较A、C、B组，差异有显著性（P0.05）; E组与D组比较，，差异无显著性（P0.05）。QPCR提示E组uPA基因相对表达量高于A、B、D组，差异有显著性（P0.05）;E组与C组比较，差异无显著性（P0.05）；E组VEGF165基因相对表达量高于较A、B、C组，差异有显著性（P0.05）；E组与D组比较，差异无显著性（P0.05）。Western blot检测表明C、E组uPA蛋白表达量高于A、B、D组，C、E组之间uPA蛋白表达未见明显差异，D组uPA蛋白表达量高于A、B组，A、B组表达少量uPA；D、E组VEGF165蛋白表达量高于A、B、C组。 结论： 1.uPA和VEGF165单基因真核表达质粒共转染人脐静脉内皮细胞后目的基因uPA和VEGF165有效表达，细胞增殖速率明显加强； 2.在细胞内上调VEGF165能促进uPA的表达； 3.本实验为转染VEGF165和uPA治疗静脉血栓性疾病的基因研究奠定前期理论基础。
【关键词】：血管内皮生长因子 尿激酶型纤溶酶原激活物 细胞增殖
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-10
• 第1章 引言10-12
• 第2章 材料与方法12-24
• 2.1 实验材料12-14
• 2.1.1 实验标本及试剂12-13
• 2.1.2 实验仪器及设备13-14
• 2.1.3 配置试剂14
• 2.2 实验方法14-24
• 2.1.1 引物合成14-15
• 2.2.2 人脐静脉内皮细胞的复苏、培养及传代15
• 2.2.3 VEGF165 和 uPA 基因真核表达质粒的构建15-18
• 2.2.4 含 VEGF165、uPA 重组质粒的菌液扩增18-19
• 2.2.5 重组质粒 DNA 的提取19
• 2.2.6 脂质体介导质粒转染人脐静脉内皮细胞19-20
• 2.2.7 实时荧光定量PCR检测细胞内目的基因VEGF165和uPAmRNA相对含量20-21
• 2.2.8 Western-Blot 技术测定 HUVECs 中 VEGF165 和uPA 的蛋白表达21-22
• 2.2.9 MTT 比色法检测并绘制细胞生长曲线22-23
• 2.2.10 统计学方法23-24
• 第3章 结果24-32
• 3.1 重组质粒检测结果24-25
• 3.1.1 PCR 酶切结果24
• 3.1.2 质检测序结果24-25
• 3.2 转染效果25-27
• 3.3 实时荧光定量 PCR 检测结果27-29
• 3.4 Western-Blot 技术测定结果29-30
• 3.5 MTT 比色法检测结果30-32
• 第4章 讨论32-39
• 第5章 结论与展望39-40
• 5.1 结论39
• 5.2 展望39-40
• 致谢40-41
• 参考文献41-44
• 攻读学位期间的研究成果44-45
• 综述45-52
• 参考文献50-52

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 周为民,李晓强,吴允明;下肢深静脉血栓形成治疗研究进展[J];解剖与临床;2002年03期

2 陈彦祥;乔卫红;刘栋良;李宗石;;阳离子脂质体的转染机制及转染效率影响因素[J];生物工程学报;2007年05期

3 周为民;宋涛;;MTRR A66G基因多态性与深静脉血栓形成的关系[J];中国普通外科杂志;2010年12期

本文编号：709698