诺如病毒荧光定量检测方法的建立及两种病毒感染性克隆构建的初步探索

发布时间：2017-08-21 00:19

本文关键词：诺如病毒荧光定量检测方法的建立及两种病毒感染性克隆构建的初步探索

【摘要】：目的：建立同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒的双重荧光定量一步RT-PCR方法,使其在对诺如病毒的检测过程中,可以同时完成定量和分型。并建立检测GⅣ型诺如病毒的荧光定量一步RT-PCR方法。此外,应用分子生物学技术,尤其是诺如病毒属其他成员的研究方法,获得诺如病毒的全基因组克隆,并利用建立的real-time检测方法及相对定量方法,对此全基因组克隆转录物的转染效果进行评价。以期为人诺如病毒的研究奠定一定的理论和技术基础。应用分子生物学技术,获得C组鼻病毒的全基因组克隆,并利用相对定量的方法,对此全基因组克隆转录物的转染效果进行评价。以期为对C组鼻病毒的进一步研究提供基础。方法： (一)双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒应用针对GⅠ、GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,构建荧光定量检测的RNA标准品,建立同时检测GⅠ、GⅡ型的双重荧光定量一步RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估。同时对粪便标本进行检测,并以传统RT-PCR的方法作为参考,对荧光定量方法进行评价。 (二)荧光定量一步RT-PCR法对GⅣ型诺如病毒检测方法的建立应用针对GⅣ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,构建荧光定量检测的RNA标准品,建立检测GⅣ型的荧光定量一步RT-PCR方法。对该方法的特异性、重复性进行评估。同时对本实验发现的GⅣ型阳性标本进行检测,并以传统RT-PCR的方法对其检测,从而验证荧光定量方法结果。 (三)对两种难培养病毒感染性克隆构建的初步探索将已获得全基因组序列的一株人诺如病毒和一株C组鼻病毒样本进行分段RT-PCR,通过人工合成或RT-PCR的方法,在病毒全基因组的5’端加上T7启动子序列,而在3’端加上Poly(A)尾结构,并利用酶切连接的方法,最终获得两种病毒的全基因组克隆。对病毒的全基因组克隆进行体外转录,在转录过程中加入帽子结构类似物,此结构以及Poly(A)尾结构,可以保证病毒基因组体外转录的RNA的稳定性,另夕(?)Poly(A)尾结构也可能和病毒的感染效力有关。获得基因组RNA后,将诺如病毒的基因组RNA转染入293细胞,将C组鼻病毒的基因组RNA转染入Hela细胞,并通过相对定量的方法,观察病毒在转染细胞内的复制情况。结果： (一)建立了双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒的方法,其在103拷贝水平可稳定检测出GⅠ和GⅡ型诺如病毒。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应。经重复性实验验证,其CT值变异系数(CV)均小于5%,表明有较好的重复性。用该方法对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。其与普通RT-PCR相比具有灵敏度高、定量准确的优势。 (二)建立了荧光定量一步RT-PCR法检测GⅣ型诺如病毒的方法,其在102拷贝水平可稳定检测出GⅣ型诺如病毒。结果表明,该方法特异性强,与GⅠ、GⅡ型诺如病毒、肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应。经重复性实验验证,其CT值变异系数(CV)均小于5%,表明有较好的重复性。其与普通RT-PCR相比具有灵敏度高、定量准确的优势。 (三)对两种难培养病毒——诺如病毒和C组鼻病毒的感染性克隆,进行了初步探索,获得了两种病毒的全基因组克隆,用相对定量的方法对转染细胞内病毒核酸的扩增进行检测,最终发现了诺如病毒和C组鼻病毒在核酸水平上,分别有约4.5倍和1.9倍的增加。并在细胞水平观察到了转染细胞的病变效应。结论：本研究建立了对感染人的三个型别的诺如病毒的荧光定量检测方法。同时检测GⅠ、GⅡ型的双重荧光定量一步RT-PCR法,以及GⅣ型的荧光定量一步RT-PCR方法效果良好,二者的灵敏度高、特异性好。可应用于胃肠炎病人中诺如病毒的检测。对G1V诺如病毒的检测也填补了国内的空白。本研究对两种难培养病毒的感染性克隆构建进行了初步探索,发现了诺如病毒和C组鼻病毒在核酸水平的扩增。并在细胞水平发现了转染细胞的病变效应。为后续对诺如病毒和C组鼻病毒的研究奠定了一定的理论和技术基础。
【关键词】：诺如病毒 C组鼻病毒 双重 荧光定量 感染性克隆
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
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