基于生物信息学分析的弓形虫致密颗粒蛋白GRA3的疫苗设计与体内验证

发布时间：2017-08-21 08:08

  本文关键词：基于生物信息学分析的弓形虫致密颗粒蛋白GRA3的疫苗设计与体内验证

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【摘要】：背景： 刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性有核细胞内寄生原虫,具有机会致病性,拥有十分广泛的宿主,例如众多哺乳动物,鸟类以及人类。弓形虫病是严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,呈世界性分布。弓形虫具有不同的基因型。分布在北美和欧洲的弓形虫主要分为三种基因型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。不同基因型的弓形虫致病机制和效应分子功能也有很大差异,亦即基因型／虫株相关的致病机制(genotype/strain-associated pathogencsis)。近年,本实验室分离获得51株动物源和人源性弓形虫株,经国际通用的PCR-RFLP和MS分型,发现了Ⅰ型,ToxoD B%204,ToxoDB#205,Chinese1(ToxoDB#9)等。其中Chinese1型弓形虫最为常见,占所有分离虫株的近80%,为中国优势基因型。深入研究该基因型虫株的相应分子和保护性抗原特征,对我国弓形虫病的发病机制、免疫诊断、疫苗研发与防治都具有十分重要的意义。 目的： 探讨我国流行的Chinese1基因型的弓形虫株GRA3作为弓形虫疫苗候选分子的潜在价值,为弓形虫病的诊断和防治提供理论和实验依据。运用生物信息学对蛋白分子进行分析,为高效候选疫苗分子的设计提供有价值的理论支持和导向依据。方法： 取小鼠传代保种的Chinese1基因型强毒Wh3株和成囊Wh6株,采用qRT-PCR检测GRA3在虫体内表达。PCR扩增GRA3的目的片段,测序比较分析。克隆致密颗粒蛋白(dense granules protein3,GRA3),构建了GRA3-GFP的真核表达质粒。将重组质粒免疫小鼠后,攻击感染弓形虫,探究GRA3DNA疫苗的免疫保护作用。采用ELISA法检测实验小鼠体内特异性抗体(IgG、IgGl和IgG2a)和细胞因子(IL-2.IL-4.IL-10和IFN-γ)表达水平；计算攻击感染后小鼠生存死亡率和脑内包囊数。通过生物信息学对Chinese1基因型虫株致GRA3进行理化性质分析、二级结构预测、抗原表位分析以及3D模型的构建等。分析动物实验的免疫保护效果与生物信息学分析结果的吻合度。 结果： (1)毒力因子的qRT-PCR检测发现,与其他Chinese1基因型虫株相比,Wh6株GRA3的表达量最高(P0.01)。 (2)通过对GRA3的氨基酸序列比对,TgCtwh6和TgCtwh3的GRA3有22个氨基酸存在差异。 (3)成功构建并表达TgCtwh3、TgCtwh6两个同一基因型不同毒力虫株的GRA3-GFP真核质粒。小鼠免疫保护实验显示,GRA3的核酸疫苗并无明显的保护作用。免疫动物的特异性抗体(IgG、IgG1、IgG2a)和细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、 IFN-γ),以及攻击感染实验小鼠死亡率和脑内成囊数,均无统计学的显著差异(P0.05)。 (4)生物信息学分析预测见到,GRA3理化性质,抗原表位和初步建立GRA3的3D模型。通过结构分析可以得出GRA3有较多的Helix,Turns和Coil区域很少,预测抗原表位较少。分析结果在体内的实验得到了验证。 结论： 本研究结果显示,Chinese1基因型弓形虫Wh3和Wh6虫株致密颗粒蛋白GRA3不仅表达量存在差异,序列上也存在多态性。致密颗粒蛋白3(GRA3)预测抗原表位较少,结构较为简单,免疫原性较差,不宜作为弓形虫有效的疫苗候选分子。本研究表明,对疫苗候选分子预先进行生物信息学分析,有助于预测其是否具有研究价值,为体内外的保护性免疫的研究提供了有力的预测手段。
【关键词】：弓形虫 GRA3 分子克隆表达 免疫保护 生物信息学
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词对照表5-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1.前言11-15
• 2.材料与方法15-37
• 3.结果37-58
• 4.讨论58-61
• 5.结论61-62
• 6.参考文献62-69
• 附录一69-73
• 附录二73-75
• 附录三 综述75-86
• 参考文献82-86

【共引文献】

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本文编号：711743