赭曲霉毒素A对GES-1细胞Rad51表达的影响及可能机制的研究

发布时间：2017-08-21 16:10

  本文关键词：赭曲霉毒素A对GES-1细胞Rad51表达的影响及可能机制的研究

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【摘要】：目的：赭曲霉毒素A（OchratoxinA, OTA）是由曲霉菌属（主要是赭曲霉）和青霉菌属产生的一种真菌毒素。在世界范围内广泛存在OTA污染，谷物、蔬菜、咖啡、饮料、动物饲料中均有检测到OTA的报道。其毒性作用包括肾毒性、肝毒性、致畸性、免疫毒性、遗传毒性和致癌性等。1993年国际癌症研究中心IARC将OTA归类为“可能的人类致癌物”。本实验室前期研究已经发现，OTA可以诱导正常人胃黏膜上皮细胞DNA双链断裂损伤和G2期阻滞，这可能与胃癌的发生发展密切相关。 哺乳动物核蛋白Rad51，与大肠埃希氏菌重组酶RecA同源，是DNA双链断裂损伤（DNA double strand breaks, DSBs）精确修复途径—同源重组（HR）的核心蛋白，其分子量为37kDa。Rad51家族成员包括：Rad51B、Rad51C、Rad51D、XRCC2和XRCC3，均参与HR修复过程。Rad51作为一种转移酶通过聚集在DNA断裂末端上形成核蛋白丝，而核蛋白丝可以促进被损伤的DNA链和未受损伤的同源姊妹染色单体进行链交换。其表达异常会直接影响HR的功能，进而影响DSBs的修复，导致基因组的不稳定和肿瘤的发生。 近年来研究发现，紫外照射、电离辐射和丝裂霉素等因素可以刺激多种细胞（包括人乳腺癌细胞、人鼻咽癌细胞和人结肠黏膜上皮细胞等）Rad51焦点形成并聚集，Rad51表达增加，从而修复DSBs。然而在各类细胞毒性因子刺激下Rad51表达和细胞毒性作用（如DNA损伤）之间的关系依然存在争议。在黄曲霉毒素B1作用下啤酒酵母菌Rad51被激活，不对等的姊妹染色单体交换增加，引起基因突变；与此同时，还有研究发现一些化疗药物、缺氧等因素可以使Rad51表达降低，加重细胞毒性作用。而目前有关OTA对人正常细胞Rad51的影响国内外均未见报道。本实验首先探讨HR修复途径中的关键分子Rad51在OTA诱导GES-1细胞DSBs以及G2期阻滞中的作用；接着进一步揭示影响Rad51表达的上游调控机制。这将为评价OTA在胃癌发生、发展中的可能作用提供科学依据。 方法：1细胞培养与处理 正常人胃黏膜上皮细胞（GES-1）常规培养在含有10%胎牛血清、100U/ml链霉素、100U/ml青霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，细胞贴壁生长。选择对数生长期的细胞（传代后24h）随机的分为溶剂对照组和实验组。溶剂对照组给予终浓度为0.08%的甲醇（以前的研究显示，当甲醇终浓度为0.08%时，通过MTT和流式细胞术检测分析其对细胞增殖和细胞周期分布均无影响）。实验组分别给予经甲醇稀释后终浓度为5μM、10μM和20μM的OTA，继续培养24h，收集细胞或者给予终浓度为20μM的OTA，而后培养6h、12h和24h后分次收集细胞进行相关指标检测。2p38和ERK阻断剂处理 取对数生长期GES-1细胞分别给予p38的阻断剂SB20358010μM或ERK的阻断剂PD9805910μM预处理0.5h，其后加入20μM OTA培养24h，再收集细胞检测Rad51的表达。3p53siRNA转染和Rad51质粒转染 用100pmol p53特异性siRNA转染细胞24h后，再加入20μM OTA继续培养24h，然后收集细胞进行相关指标检测。其阴性对照为Negtivecontrol siRNA（NC siRNA）。2μg表达Rad51的质粒和作为阴性对照的空质粒也被瞬时转染进GES-1细胞中，在此基础上加入20μM OTA继续培养24h，再收集细胞进行相关指标检测。4蛋白免疫印迹（Western blot） 各种因素处理GES-1细胞后，提取细胞总蛋白，用蛋白免疫印迹方法，检测OTA处理后人胃黏膜上皮细胞GES-1中各种指标的表达情况。5实时定量PCR（Quantitative real-time PCR） 利用实时定量PCR检测不同处理方式对人胃黏膜上皮细胞GES-1中Rad51mRNA表达的影响。每组样品以目的基因与内参照基因人类管家基因β-actin量的比值表示目的基因相对表达量,用比较Ct值的方法进行统计学分析。6免疫荧光技术（Immunofluorescence staining） GES-1细胞固定后用Rad51一抗和荧光二抗孵育，再用DAPI复染DNA。最后在激光共聚焦显微镜下观察OTA处理细胞后Rad51的表达情况并拍照。7流式细胞术检测细胞周期（FCM） 转染和OTA处理后，分别收集各组细胞，再PBS洗涤，离心收集细胞，用70%冰乙醇固定后利用流式细胞术检测细胞周期分布情况。8免疫共沉淀（IP） 提取GES-1细胞总蛋白120μg，各组蛋白加入5μg CyclinB1抗体4℃摇床过夜，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Cdc2-CyclinB1复合物的形成情况。9统计学分析 每组实验不少于3次独立样本的重复，采用SPSS软件（13.0）进行相关与回归分析（analysis of Correlation and Regression）、t检验和单因素方差分析（analysis of variance,ANOVA），数据用x±s表示，检验以P0.05为差异有显著性意义。 结果：1OTA通过剂量和时间依赖的方式诱导GES-1细胞DNA双链断裂标志物γ-H2AX蛋白表达的增加 Western blot结果显示，和溶剂对照组相比，5μM、10μM和20μM OTA处理24h后，γ-H2AX蛋白表达水平呈逐渐上升的趋势(r=0.895, P0.05)。同时，20μM OTA处理细胞6h、12h和24h后，γ-H2AX蛋白水平随着时间的延长也明显升高(r=0.926, P0.05)。2OTA通过剂量和时间依赖的方式抑制GES-1细胞Rad51在mRNA及蛋白水平的表达2.1Rad51在mRNA水平上的表达： Real-time PCR结果显示，5μM、10μM和20μM OTA处理GES-1细胞24h后，Rad51在mRNA水平上的表达逐渐降低(r=-0.909, P0.05)。20μM OTA（此剂量抑制Rad51表达最明显）分别处理GES-1细胞6h、12h和24h后，随着处理时间延长，Rad51在mRNA水平上的表达也逐渐降低(r=-0.984, P0.05)。2.2Rad51在蛋白水平上的表达： 与mRNA水平上的表达一致的是，Western blot结果显示，和溶剂对照组相比，OTA5μM、10μM和20μM处理24h后，Rad51蛋白表达水平呈逐渐降低的趋势(r=-0.952, P0.05)。同时，OTA20μM处理细胞6h、12h和24h后，Rad51蛋白水平的表达水平也逐渐降低(r=-0.989, P0.05)。 2.3OTA导致GES-1细胞Rad51焦点的数量减少免疫荧光结果显示，20μM OTA处理的细胞中Rad51焦点的数量明显少于溶剂对照组（P0.05）。以上结果提示OTA可以下调Rad51的表达，进而抑制HR修复途径。 3利用质粒瞬时转染Rad51可逆转OTA对GES-1细胞的损伤作用 3.1Rad51过表达对OTA诱导的GES-1细胞DSBs的影响 Western blot结果显示，与空质粒+OTA组相比，Rad51质粒+OTA组中γ-H2AX的蛋白表达水平明显降低（P0.05）。结果提示Rad51过表达可以抑制OTA诱导的DSBs的发生。 3.2Rad51过表达对OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞的影响 FCM结果发现，Rad51质粒+OTA组中G2/M期细胞比例与空质粒+OTA组相比明显降低（P0.05）。结果提示Rad51过表达可以逆转OTA诱导的GES-1细胞G2阻滞。 Western blot结果显示，与空质粒+OTA组相比，Rad51质粒+OTA处理组G2/M期关键蛋白（Cdc25C、Cdc2和CyclinB1）的表达水平明显增加（P0.05）。同时免疫共沉淀结果显示，Rad51质粒转染后，与空质粒+OTA处理组相比，Rad51质粒+OTA处理组Cdc2-CyclinB1复合物的形成明显增多（P0.05）。4OTA处理引起GES-1细胞Rad51降低的可能分子机制 我们前期实验发现，，OTA处理后的GES-1细胞可激活ERK、p38和p53信号通路，进而调控OTA诱导的G2阻滞。4.1ERK和p38信号通路在OTA下调GES-1细胞Rad51表达中的作用 Western blot结果显示，与OTA处理组相比，ERK特异性阻断剂（PD98059）预处理+OTA处理组Rad51的表达明显升高（P0.05）。同时，p38特异性阻断剂（SB203580）预处理也抑制了OTA导致的Rad51表达降低（P0.05）。结果提示ERK和p38信号通路可能是OTA下调GES-1细胞Rad51表达的机制之一。4.2p53在OTA下调GES-1细胞Rad51表达中的作用 Western blot检测结果显示，p53siRNA+OTA处理组细胞中Rad51蛋白的表达水平与NC siRNA+OTA处理组相比明显增加（P0.05）。结果表明，p53基因的激活参与调节了OTA引起的GES-1细胞Rad51表达降低。 结论： 1赭曲霉毒素A处理引起GES-1细胞DNA双链断裂损伤，同时抑制细胞中Rad51的表达。 2过表达Rad51可以显著逆转赭曲霉毒素A诱导的GES-1细胞DNA双链断裂损伤作用。 3过表达Rad51可以缓解赭曲霉毒素A诱导的GES-1细胞G2期阻滞。 4ERK和p38MAPK信号通路以及p53基因的激活参与赭曲霉毒素A抑制Rad51表达的调控。
【关键词】：Rad51 同源重组修复途径 赭曲霉毒素 人永生化胃黏膜上皮细胞 DNA 双链断裂 G2期阻滞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-18
• 材料与方法18-30
• 结果30-33
• 附图33-45
• 附表45-46
• 讨论46-49
• 结论49-50
• 参考文献50-56
• 综述 DNA 损伤修复和细胞周期检测点阻滞对维持基因组稳定性的重要意义的研究进展56-69
• 参考文献63-69
• 致谢69-71
• 个人简历71

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