PKC或PKA诱导Talin高化学计算磷酸化反向调控Calpain介导的蛋白裂解和细胞迁移

发布时间：2017-08-22 13:07

  本文关键词：PKC或PKA诱导Talin高化学计算磷酸化反向调控Calpain介导的蛋白裂解和细胞迁移

  更多相关文章： Talin 高化学计算磷酸化 calpain介导的酶切(蛋白裂解) 粘附斑解体 PKC或PKA

【摘要】：粘附斑是一个由180多种蛋白组成的蛋白复合物,向外能连接ECM,向内则与肌动蛋白细胞骨架以及潜在的细胞迁移信号级联网络进行连接。在粘附斑的转换的过程中,Talin因为它的calpain酶切位点介导的蛋白裂解作用而对粘附斑解聚起至关重要的作用,但调控机制还未得到很好的阐明。现在我们证明：由PKC或PKA诱导的talin头部三个高化学计算磷酸化位点磷酸化反向调控Calpain介导的蛋白裂解和细胞迁移。定点突变封闭高化学计算磷酸化,导致对talinT144A+T150A的影响为：苏氨酸磷酸化水平的下降和PKC活性的增强；而对talinS446A的影响为：丝氨酸磷酸化水平的下降和PKA活性的增强。talinT144A+T150A蛋白的表达刺激Calpain介导的蛋白裂解,因而刺激粘附斑解体和细胞迁移,而talinS446A蛋白表达则能完全抑制talin的calpain酶切,因而阻止粘附斑解体和细胞迁移。PKC通过MAPK级联信号途径激活ERK并最终激活calpain,而PKA则表现为：不能完全抑制ERK的激活,但对抵消calpain的酶切活性。这些结果证实和强调了PKC或PKA诱导位点特异的Talin高化学计算磷酸化调控Calpain介导的蛋白裂解和粘附斑解体,因此控制粘附斑稳定性,细胞粘附并最后调控细胞迁移的巨大作用。本文的创新点有以下几点：一是所用细胞系全是经过BD FACSAriaIII流式细胞分选仪(在488nm波长下激发)最终分拣得到的完全均一的EGFP阳性细胞群；二是第一次把calpain酶切的机制和高化学计算磷酸化机制结合在一起进行阐述；三是所得实验结果不仅完全符合假设,而且能和MAPK信号途径产生新的联系,是基础领域内新的突破性进展。
【关键词】：Talin 高化学计算磷酸化 calpain介导的酶切(蛋白裂解) 粘附斑解体 PKC或PKA
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329;Q26
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 1. 引言与文献综述9-22
• 1.1 细胞迁移、细胞粘附的形成与解体9-14
• 1.2 Talin蛋白14-17
• 1.3 Calpain 2的酶切17-19
• 1.4 重组PCR法诱导定点突变19-20
• 1.5 研究目的和意义20-22
• 2. 材料与方法22-51
• 2.1 材料22-32
• 2.1.1 仪器设备22-23
• 2.1.2 主要试剂和耗材23-25
• 2.1.3 动物细胞系与菌种25
• 2.1.4 常用溶液的配制方法25-32
• 2.2 方法与步骤32-51
• 2.2.1 Talin(头部片段)定点突变及表达载体的构建32-39
• 2.2.2 细胞培养39-40
• 2.2.3 蛋白的处理40-43
• 2.2.4 Western blotting技术43-46
• 2.2.6 非放射性检测PKC或PKA的活性46-48
• 2.2.7 细胞迁移和细胞粘附实验48-51
• 3. 结果与分析51-67
• 3.1 Calpain 2酶切效果检测51-52
• 3.2 RNA干扰确认calpain 2的酶切功能52-53
• 3.3 苏氨酸或丝氨酸的磷酸化抗体检测53-55
• 3.4 PKC,PKA含量测定55-58
• 3.5 MAPK级联途径,ERK的激活58-59
• 3.6 免疫荧光双定位验证粘附斑的形成59-61
• 3.7 粘附斑实时观察解体61-62
• 3.8 细胞群粘附水平直观比较62-63
• 3.9 细胞群粘附水平定量比较63-64
• 3.10 Wound-healing(划痕)assays和Transwell assays64-67
• 4. 讨论67-71
• 4.1 粘附斑形成,解体与细胞迁移67-68
• 4.2 与MAPK级联途径建立联系68-69
• 4.3 实验中遇到的困难及解决办法69-71
• 5. 结语71-73
• 参考文献73-76
• 致谢76-77
• 攻读学位期间科研成果77-78

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 吴丛梅,黄天华,吴德生,谢庆东,徐小虎;pEgr-P16重组质粒的构建及其在EC9706细胞中的辐射诱导表达[J];癌变.畸变.突变;2003年04期

2 阮烨,王晓云,谢庆东,黄天华;外源DNA转染精子的实验研究[J];癌变.畸变.突变;2004年03期

3 欧阳松应,徐寿水,沈文律,周传香,李春艳,欧阳红生;人PTEN基因表达载体的构建及其在U_(251)细胞中的表达[J];癌变.畸变.突变;2004年04期

4 陈传德,吴中亮,陈家X;乙酸镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析[J];癌变.畸变.突变;2005年01期

5 熊小芳,黄天华,谢庆东,王晓梅,陈桂兰;精子携带的HBV DNA在小鼠早期胚胎中的复制与表达[J];癌变.畸变.突变;2005年03期

6 吕慧贞;张建朋;陈新;刘静;张元湖;;一种改进的鸭梨总RNA提取方法[J];山东农业科学;2007年05期

7 张秀华;王文锋;;微卫星DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术的探讨[J];山东农业科学;2009年06期

8 张学民,王金生;碱裂解法提取质粒DNA方法的改进[J];安徽大学学报(自然科学版);2000年04期

9 倪大虎,向太和,张盘娣,吴家道,杨剑波,贾士荣,余增亮;应用低能离子束将抗菌肽ShivaA基因导入恢复系明恢63的研究(简报)[J];安徽农业科学;2000年04期

10 许晓风,郁锋,杨启银,陈育如,彭荣淮,贺海生,王程辉;烟草工业下脚料综合利用研究(I)——抗菌成分的提取与抑菌效果测定[J];安徽农业科学;2003年02期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 黄家强;卜夏;李卓娅;龚非力;;人TNFα分泌型、跨膜型和跨膜稳定型重组体的构建表达及杀瘤效应[A];生命科学与生物技术：中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年

2 郭昱嵩;王中铎;刘楚吾;陈志明;刘筠;;勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)线粒体DNA全序列的测定与分析[A];中国海洋学会2007年学术年会论文集（下册）[C];2007年

3 樊继德;孔庆国;张梅;于喜艳;;子房注射法获得转基因甜瓜植株[A];中国园艺学会第七届青年学术讨论会论文集[C];2006年

4 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫表面抗原SAG2基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年

5 李俊华;吴少庭;翁亚彪;甘燕;刘洪波;刘茂铃;张仁利;高世同;黄达娜;耿艺介;;弓形虫致密颗粒蛋白GRA4基因体外扩增、克隆及在Mycobacterium smegmatis mc2155中的表达[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年

6 唐小江;马争;黄建勋;黄汉林;李来玉;牛侨;;正己烷引起红细胞膜血影蛋白交联的研究[A];中国环境诱变剂学会抗诱变剂和抗癌剂专业委员会第三次全国学术会议、中国毒理学会生化与分子毒理专业委员会第五届学术交流会、贵州省环境诱变剂学会成立大会暨首届学术交流会论文集[C];2004年

7 严家彬;李新辉;吴淑勤;杜合军;;鳜鱼病毒核酸特异片段表达及高效价抗体制备[A];可持续水产养殖——资源、环境、质量——2003水产科技论坛论文集[C];2003年

8 赵晓瑜;柳伟强;李晓霞;;蚯蚓抗菌肽40kDa Fetidin基因的原核表达与复性[A];2007年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2007年

9 张核子;王保捷;丁酶;肖仰哲;巴颖;李剑平;李春梅;刘利民;赖跃;;短串联重复位点FGA扩增片段长度多态性研究[A];第二次全国法医物证学学术交流会论文集[C];1998年

10 胡姣;谭晓风;张琳;龙洪旭;田晓明;;油茶种子胚乳总RNA提取方法研究及改良[A];第二届中国林业学术大会——S9 木本粮油产业化论文集[C];2009年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 梁勇;白念珠菌高铁还原酶基因表达调控及Aft2p转录因子的功能研究[D];南开大学;2010年

2 于双妮;胰腺癌差异表达microRNAs的鉴定及功能研究[D];北京协和医学院;2008年

3 陈其华;前癃通胶囊治疗良性前列腺增生症临床观察及其对间质细胞作用的实验研究[D];湖南中医药大学;2011年

4 马丽菊;云南宣威肺癌细胞系侧群细胞特征分析[D];昆明医学院;2011年

5 许雷;大青杨纤维素合酶基因的克隆与遗传转化的研究[D];东北林业大学;2011年

6 朱伟;摄食抑制因子NUCB2/Nesfatin-1对机体胰岛素敏感性的影响[D];重庆医科大学;2011年

7 王金鹏;4α糖基转移酶环化活性定向控制及其大环糊精产物的分离及应用研究[D];江南大学;2011年

8 程光平;巴马~P唇渻生物学及遗传学研究[D];中国海洋大学;2011年

9 宋娜;西北太平洋两种海洋鱼类的分子系统地理学研究及分子标记在褐牙鲆增殖放流中的应用[D];中国海洋大学;2011年

10 郭里;若干图论问题的DNA计算机算法研究[D];湖南大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 朱晓娟;重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL的构建、表达、纯化及初步鉴定[D];南京医科大学;2009年

2 钱静;携带Apoptin双调控溶瘤腺病毒治疗肝癌的研究[D];浙江理工大学;2010年

3 辛宁;PDX-1真核表达载体构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达[D];郑州大学;2010年

4 陆玉成;AMF基因在食管鳞癌细胞株中的表达及功能初步分析[D];郑州大学;2010年

5 吕文兵;杜氏盐藻异养转化藻株的鉴定及初步功能分析[D];郑州大学;2010年

6 李静;父源性HLA-A基因与子痫前期相关性研究[D];郑州大学;2010年

7 张燕松;肾移植术后患者PBMCs中NF-κB的活性和TNF-α mRNA的表达研究[D];郑州大学;2010年

8 张磊;杜氏盐藻（Dunaliella salina）GPI多克隆抗体的制备及其在MDCK细胞中的定位[D];郑州大学;2010年

9 冯玖玲;杜氏盐藻RbcS基因家族新成员的克隆及功能研究[D];郑州大学;2010年

10 陈操;日本七鳃鳗抗增殖蛋白Prohibitin1研究及类B淋巴细胞免疫调节初探[D];辽宁师范大学;2010年

，

本文编号：719289