人源化肝脏嵌合体小鼠模型的建立及MSC介导的免疫抑制作用在肝细胞移植中的应用

发布时间：2017-08-22 17:18

  本文关键词：人源化肝脏嵌合体小鼠模型的建立及MSC介导的免疫抑制作用在肝细胞移植中的应用

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【摘要】：应用人肝细胞异种移植到受体鼠肝内建立人源化肝脏的嵌合体小鼠（人鼠嵌合肝），对药物代谢、乙肝病毒等嗜肝性病毒及其疫苗的研究具有重要的意义。延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因剔除小鼠（Fah~(-/-)小鼠），是模拟遗传型酪氨酸血症I型疾病建立的小鼠模型。作为国际上公认度很高的肝损伤模型之一，Fah~(-/-)小鼠已被广泛应用于肝脏再殖的研究。Fah~(-/-)小鼠是开展肝细胞移植的理想模型，100个移植的肝细胞就可重建肝小叶的结构与功能。非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠具有T、B淋巴细胞联合免疫缺陷、NK细胞活性低下、无循环补体、无巨噬细胞和抗原提呈细胞功能损害等多种先天和获得性免疫缺陷，不易发生免疫逃逸，是理想的异种移植模型。本研究结合Fah~(-/-)小鼠的肝脏再殖优势与Nod/Scid小鼠可以异种移植的特点，将两个品系杂交繁育建立Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠品系,开展人肝细胞移植到Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠建立人源化肝脏嵌合体小鼠模型的研究。通过对人的肝细胞在Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠肝脏中再殖及其程度观察，评价再殖的人肝细胞能否具有正常的肝细胞功能，评价利用人肝细胞移植Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠建立人鼠嵌合肝模型的可行性。 同时，在临床上开展肝细胞移植治疗肝脏疾病的实践中，应用同种异基因人肝细胞移植时可能导致的免疫反应是不得不考虑的问题。间充质干细胞（MSCs）能与先天或获得性免疫系统的细胞相互作用，通过调节免疫系统的效应分子发挥免疫抑制和组织修复的作用，为其在临床上应用以调节肝细胞移植时的免疫反应提供了可能的选择方案。因此，在第二部分研究中，我们以同种异基因小鼠肝细胞与MSCs混合移植Fah~(-/-)小鼠模型，以移植细胞是否再殖受体小鼠肝脏作为评价指标，观察间充质干细胞在肝细胞移植中是否发挥免疫抑制作用，以及这种作用是否能促进同种异基因小鼠肝细胞在受体肝脏中的再殖。 在第一部分研究中，首先，通过杂交、基因型鉴定和保种繁育，我们建立了Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠品系，该小鼠品系可以纯合保种并且能够正常繁殖；其次，我们开展了同种异基因小鼠肝细胞移植Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠的工作。通过观察小鼠肝细胞在Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠肝脏中的再殖及其程度，评价建立的Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠是否具备免疫缺陷Fah~(-/-)小鼠的基本生物学特性，，为下一步进行人肝细胞移植建立人鼠嵌合肝模型奠定基础；第三，分离原代人肝细胞并移植Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠。在人肝细胞移植前后，我们针对受体鼠采取了一些预处理措施，包括：移植前一周逐步撤除Fah~(-/-)抑制药物NTBC，提前诱导受体小鼠肝脏的损伤来形成有利外源细胞植入的微环境；细胞移植后用临床常用的免疫抑制剂——FK506抑制异种细胞移植后的免疫排斥反应，促进植入人肝细胞的增殖。通过以上处理措施，观察人肝细胞在Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠肝脏中再殖及再殖的肝细胞是否有正常的肝细胞功能。免疫组织化学染色结果表明，移植的人肝细胞能够在Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠肝脏中显著增殖，肝脏再殖程度可达30%以上。采用体重曲线、肝功能生化和人肝细胞功能蛋白表达等三方面指标评价嵌合肝脏中人肝细胞的功能，结果表明再殖的肝细胞具有正常人肝细胞的功能。以上结果表明，Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠可以作为理想的可规模化应用的人鼠嵌合肝模型，该技术体系的改进简化了Fah~(-/-)小鼠作为人源化肝脏小鼠模型的实用性问题。 在第二部分研究中，应用提前撤除受体小鼠抑制药物NTBC的预处理方案，我们分别将未处理及以细胞因子IFN-γ和TNF-α活化处理的MSCs混合C57BL/6J品系小鼠肝细胞移植129S4品系的Fah~(-/-)小鼠，同时选择在混合移植前1天及移植后1、3、5、7天分别对受体尾静脉注射MSCs以增强其免疫抑制作用。采用免疫组织化学、体重曲线以及肝脏生化指标，观察不同处理的MSCs在同种异基因小鼠肝细胞移植中的免疫抑制作用。结果表明，C57BL/6J肝细胞单独移植129S4Fah~(-/-)小鼠时，未见任何移植细胞的植入和增殖；C57BL/6J肝细胞混合未经细胞因子诱导处理MSCs移植时，129S4Fah~(-/-)小鼠肝脏中出现单个散在的移植细胞植入；C57BL/6J肝细胞混合经细胞因子IFN-γ和TNF-α活化处理MSCs移植时，移植细胞在受体肝脏中的再殖程度提高，损伤的肝脏功能明显改善。这些结果初步表明MSCs在同种异基因小鼠肝细胞移植中发挥了一定的免疫抑制作用，并改善了受体小鼠的肝脏功能，为进一步开展应用MSCs调节临床上肝细胞移植后的免疫抑制作用奠定了基础。
【关键词】：FAH基因剔除小鼠 人源化肝脏 肝细胞移植 免疫抑制 间充质干细胞
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R-332;R392
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 缩略词表9-10
• 前言10-13
• 第一部分 人源化肝脏嵌合体小鼠模型的建立13-35
• 实验材料13-17
• 实验方法17-25
• 实验结果25-32
• 讨论32-35
• 第二部分 MSC 介导的免疫抑制作用在肝细胞移植中的应用35-52
• 实验材料35-39
• 实验方法39-43
• 实验结果43-50
• 讨论50-52
• 综述52-60
• 参考文献60-68
• 硕士在读期间发表论文及获奖情况68-69
• 致谢69

【参考文献】

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1 苏宝亮;刘长城;向导;张海斌;袁斯明;王敏君;陈费;朱海英;何志颖;王欣;胡以平;;人成体肝细胞在Fah~(-/-)Nod/Scid小鼠肝脏中的显著增殖[J];中国科学:生命科学;2010年10期

本文编号：720383