HLA-A2限制性survivin点突变抗原肽特异性TCR基因筛选及抗肿瘤功能验证

发布时间：2017-08-25 04:46

  本文关键词：HLA-A2限制性survivin点突变抗原肽特异性TCR基因筛选及抗肿瘤功能验证

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【摘要】：目的：通过HLA-A2限制性survivin点突变抗原肽（Sur79M2）体外刺激T淋巴细胞，，筛选特异性识别Sur79M2的TCR基因。构建TCR基因双表达载体，包装重组嵌合型腺病毒并转染T淋巴细胞，研究转Sur79M2特异性TCR基因T细胞的抗肿瘤功能，为今后点突变肿瘤相关抗原（TAA）的特异性T细胞过继性肿瘤治疗新方法和新型靶点TCR基因治疗药物奠定基础。 方法： 一.分离HLA-A2+健康人外周血单个核细胞（PBMC），体外诱导DC细胞，成熟DC细胞负载Sur79M2与T淋巴细胞共培养，对照组DC未负载Sur79M2与T淋巴细胞共培养。流式细胞术检测T细胞抗原受体（TCR）Vβ亚家族表达谱。 二.多重基因分析系统Gexp检测Sur79M2刺激的实验组及对照组T细胞抗原受体（TCR）Vα和Vβ亚家族表达格局。 三.提取实验组RNA，克隆Sur79M2特异性TCRVα和Vβ基因，构建重组嵌合型腺病毒穿梭质粒p315TCRVα-IRES-Vβ。 四.通过Lipofectamine2000脂质体转染的方法，将腺病毒骨架质粒与构建的腺病毒穿梭质粒p315TCR Vα-IRES-Vβ共转染HEK293细胞，包装表达目的基因的重组腺病毒。获得的初病毒提取病毒基因组DNA，PCR扩增目的基因及腺病毒骨架质粒纤毛基因进行鉴定。病毒转染淋巴细胞，检测目的基因的转染效率。将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒大量扩增，过滤TCID50法测病毒滴度。 五.腺病毒转染PBMC36小时后，分别作T2细胞负载Sur79M2（HLA-A2+、Survivin+）、肝癌细胞株HepG2（HLA-A2+、Survivin+）、乳腺癌细胞株Mcf-7（HLA-A2+、Survivin+）、肝癌细胞株7402（HLA-A2-、Survivin+）及肺癌细胞株NCI-H1299（HLA-A2-、Survivin-），12h、24h、36h三个时间点MTT检测杀伤效果及Elisa法检测IFN-γ的分泌。 结果：经DC负载Sur79M2刺激的PBMC流式检测TCRVβ亚家族表达情况发现TCRVβ7.1亚家族表达明显升高，而Gexp检测TCRVα和Vβ基因表达显示TCRVα4和Vβ7基因出现单一主峰的寡克隆峰图。克隆TCRVα4和Vβ7基因后测序分析CDR3序列证实TCRVα4和Vβ7基因发生了克隆增殖现象。构建腺病毒穿梭质粒p315-TCRVα4-IRES-Vβ7，包装重组嵌合型腺病毒，并从病毒中扩增出目的基因。重组嵌合型腺病毒转染淋巴细胞后流式检测能有效检测到目的基因的表达。MTT法检测杀伤效率依次为T2负载肽 HepG2（HLA-A2+、Survivin+） Mcf-7（HLA-A2+、Survivin+）7402（HLA-A2-、Survivin+） NCI-H1299（HLA-A2-、Survivin-），IFN-γ的分泌情况几乎与MTT杀伤效率一致。 结论：通过DC负载Sur79M2体外刺激T淋巴细胞的方法，成功筛选到Sur79M2特异性TCRVα4和Vβ7基因。克隆特异性TCRVα4和Vβ7基因并成功构建了重组嵌合型腺病毒穿梭质粒p315-TCRVα4-IRES-Vβ7。体外抗肿瘤功能研究中Sur79M2特异性TCRVα4和Vβ7基因显示出有效识别及杀伤负载了Sur79M2T2细胞的能力，而且对于表达野生型survivin抗原的肿瘤细胞株也具有一定的活化杀伤功能。
【关键词】：survivin TCR Vα4 TCR Vβ7 重组嵌合型腺病毒 HLA-A2
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-15
• 第一部分 SUR79M2 体外刺激健康人外周血单个核细胞及流式检测 TCRVΒ亚家族表达谱15-23
• 引言15
• 1.1 材料15-16
• 1.1.1 样本15
• 1.1.2 试剂15
• 1.1.3 仪器15-16
• 1.2 方法16-18
• 1.2.1 实验样本采集16
• 1.2.2 健康人外周血白膜 HLA 分型检测16-17
• 1.2.3 健康人外周血白膜淋巴细胞的分离17
• 1.2.4 DC 细胞的诱导17
• 1.2.5 DC 细胞表型分析17-18
• 1.2.6 DC 细胞负载 Sur79M2 并刺激 T 淋巴细胞18
• 1.2.7 流式细胞仪检测体外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴细胞中 TCRVβ亚家族表达情况18
• 1.3 结果18-22
• 1.3.1 流式检测健康人白膜样本 HLA 型别18-19
• 1.3.2 DC 细胞形态学观察19-20
• 1.3.3 流式检测成熟细胞表型20-21
• 1.3.4 流式细胞仪检测体外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴细胞中 TCRVβ亚家族表达情况21-22
• 1.4 小结22-23
• 第二部分 GEXP 检测 TCRVΑ、Β链基因表达情况23-32
• 引言23
• 2.1 材料23
• 2.1.1 试剂23
• 2.1.2 仪器23
• 2.2 方法23-27
• 2.2.1 Gexp 检测体外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴细胞中 TCRVα、β链基因表达情况23-27
• 2.3 结果27-31
• 2.3.1 Gexp 检测体外 Sur79M2 刺激后 T 淋巴细胞中 TCRVα、β链基因表达情况27-31
• 2.4 小结31-32
• 第三部分 TCRVΑ4、VΒ7 基因克隆及 P315-TCRVΑ4-IRES-VΒ7 双表达穿梭载体构建32-45
• 引言32
• 3.1 材料32
• 3.1.1. 质粒、菌株、试剂32
• 3.1.2 仪器32
• 3.2 方法32-39
• 3.2.1 获得 TCRVα4、Vβ7 基因32-34
• 3.2.2 胶回收 PCR 产物连接 T 载体34-35
• 3.2.3 质粒转化及质粒提取35-36
• 3.2.4 构建 p315-TCRva4-IRES-vb7 双表达穿梭载体36-39
• 3.3 结果39-44
• 3.3.1 获取 TCRVα4 、Vβ7 基因39
• 3.3.2 TCRVα4 、Vβ7 基因连接 T 载体测序结果39-41
• 3.3.3 构建 p315-TCRVα4-IRES-Vβ7 双表达穿梭载体结果41-44
• 3.4 小结44-45
• 第四部分 重组嵌合型腺病毒 AD5/F35 的包装、鉴定以及滴度测定45-51
• 引言45
• 4.1 材料45
• 4.1.1 质粒、细胞和试剂45
• 4.1.2 仪器45
• 4.2 方法45-48
• 4.2.1 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35. p315-TCRVα4-IRES-Vβ7 的包装45-46
• 4.2.2 重组嵌合型腺病毒鉴定46-48
• 4.3 结果48-50
• 4.3.1 HEK-293 细胞包装腺病毒48
• 4.3.2 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35. TCR Vβ 7 的 PCR 鉴定48-49
• 4.3.3 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35.p315-TCR Vα4-IRES-TCR Vβ7 流式鉴定49-50
• 4.3.4 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35 p315-TCRVα4-IRES-Vβ7 扩大培养50
• 4.4 小结50-51
• 第五部分 SUR79M2 优势取用基因 TCR VΑ4、VΒ7 重组腺病毒抗瘤谱51-59
• 引言51
• 5.1 材料51
• 5.1.1 细胞、试剂51
• 5.1.2 仪器51
• 5.2 方法51-53
• 5.2.1 检测肿瘤细胞株中 HLA 分型及 survivin 表达情况51-52
• 5.2.2 MTT 比色法检测 survivin 抗原肽优势取用基因 TCR Vα4、Vβ7 重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤效果52-53
• 5.2.3 Elisa 试剂盒检测 IFN-γ的释放53
• 5.3 结果53-57
• 5.3.1 肿瘤细胞株中 HLA 分型及 survivin 表达情况53-55
• 5.3.2 MTT 比色法检测 Sur79M2 优势取用基因 TCRva4、vb7 重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤效果55-56
• 5.3.3 IFN-γ的释放检测结果56-57
• 5.4 小结57-59
• 讨论59-64
• 参考文献64-70
• 附录一 英文缩略词表70-71
• 附录二 质粒图谱71-74
• 附录三 引物列表74-76
• 附录四 攻读学位期间发表的论文76-77
• 致谢77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：735170