GSK3β对Drp1磷酸化调节的机制及其功能的研究

发布时间：2017-08-26 10:34

  本文关键词：GSK3β对Drp1磷酸化调节的机制及其功能的研究

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【摘要】：线粒体的动态平衡是指线粒体处于不断分裂和融合的稳态中,此过程主要受分裂蛋白Drp1、Fis1及融合蛋白MFN1/2、OPA1所调控。相关的研究证实,在神经退行性疾病尤其是阿兹海默综合症(AD)及亨廷顿舞蹈症(HD)中,神经元的动态平衡受损从而导致线粒体呈过度分裂状态,进而影响神经元内的ATP产生、凋亡信号的释放并导致突触功能的减退。但是,线粒体过度分裂的分子机制仍不清楚。糖原合成酶激酶3β (GSK3β)是神经元中一种重要的激酶,广泛参与神经元的发育、分化、凋亡等各个方面,对于神经元正常功能的维持至关重要。近年的研究显示,GSK3β活性的异常升高可能是导致AD发生的关键因素。而其中,GSK3β是否可以调节线粒体的动态平衡并导致疾病的发生对于AD发病机制的研究具有非常重要的价值。先前的相关研究证实,真菌中GSK3β与Drp1存在蛋白间的相互作用,提示GSK3β与Drp1的相互作用可能存在于神经元中,并可能对神经元功能的维持发挥重要作用。 为了研究GSK3β能否通过Drp1来调控神经元中线粒体的动态平衡,我们设计了一系列免疫荧光及蛋白印迹的实验研究具体的分子机制,并建立小鼠的行为学模型观察干预两分子结合后对其学习与记忆能力的影响,阐明了GSK3β与Drp1的相互作用在AD发生中可能起到的作用。研究结果如下： 1. GSK3β活性升高促进线粒体的分裂 在体外培养7天的神经元中,与对照组相比,过表达GSK3β会导致线粒体变短,同时含有分裂状态线粒体的神经元比例显著上升；而用GSK3β抑制剂AR-A014418处理会导致线粒体变长,同时含有分裂状态线粒体的神经元显著下降。 2.Drp1参与GSK3β调控的线粒体过度分裂 用小干扰RNA抑制Drp1表达之后,GSK3β无法诱导线粒体的分裂,证明GSK3β调控线粒体分裂是依赖于Drp1的。并通过免疫共沉淀与免疫荧光共定位实验进一步确定实验结果。 3.Drp1上40及44位丝氨酸的磷酸化控制GSK3β调控的线粒体过度分裂 首先用生物信息学方法预测Drp1上GSK3β磷酸化的潜在位点,并通过分子克隆技术对分值较高的位点进行点突变,模拟该位点持续磷酸化及持续去磷酸化的状态；然后用观察线粒体形态的方法寻找实际的位点。经过形态学的观察,确定Drp1上40及44位的丝氨酸被GSK3β磷酸化之后,可明显促进线粒体的分裂。 4.Drp1上40及44位丝氨酸通过不同的分子机制被GSK3β磷酸化 为了确定两个位点磷酸化的机制,首先制备了针对两个位点的特异性磷酸化抗体并验证其效率；随后用特异性磷酸化抗体确定Drp1上44位丝氨酸可被GSK3β直接磷酸化,而40位丝氨酸需要44位丝氨酸先被磷酸化为基础。 5.Drp1磷酸化导致其GTPase活性升高及线粒体组分分布增加 通过GTPase活性检测显示,磷酸化Drp1相比对照组Drp1的GTPase活性显著增加；而通过提纯线粒体组分后蛋白印迹发现磷酸化后的Drp1大部分分布于线粒体组分中,而去磷酸化的Drp1更多的分布于胞浆中；此外,二聚化实验的结果说明Drp1的磷酸化对于其二聚化的形成并没有影响。 6.Drp1磷酸化会导致线粒体过度分裂并降低ATP的产生和树突脊的形成 形态分析实验证明Drp1磷酸化会导致线粒体过度分裂。进一步的生化和免疫荧光实验证明Drp1磷酸化会导致细胞内ATP产量降低,并影响神经元突触的形成。 7. Tat-Drp1DD阻断GSK3β与Drp1的结合并检测其效率 在之前工作的基础上,设计多肽Tat-Drp1DD干扰GSK3β与Drp1的结合,并检测药物处理后的Drp1磷酸化；此外,多肽处理神经元之后可观察到线粒体形态有一定程度的恢复。 8.海马脑区注射Tat-Drp1DD可改善AD小鼠的学习与记忆能力 实验选取12个月左右已显现痴呆症状的AD小鼠为研究对象,在AD小鼠脑内注射多肽14天后,处死并取海马脑区做蛋白印迹分析,结果显示药物处理后海马脑区的Drp1磷酸化水平显著降低。同时,小鼠脑内caspase3活性下降,突触蛋白synaptophysin表达量回升。此外,免疫组化结果显示小鼠脑内的amyloid β沉积明显下降。 9. Tat-Drp1DD可降低AD小鼠海马脑区的Drp1磷酸化水平 在行为学检测中,实验组用Tat-Drp1DD进行海马脑区注射,随后的新奇物体认知及水迷宫的行为学实验结果显示,与对照组相比,实验组小鼠的学习与记忆能力显著上升。 结论： 通过分子细胞水平到动物行为学水平的一系列实验,我们证实GSK3β通过磷酸化Drp1上40位及44位的丝氨酸诱导线粒体的分裂,并对其具体的分子机制进行了深入的研究。同时,在AD小鼠中,设计多肽干扰GSK3β与Drp1的结合可以有效的降低Drp1的磷酸化,并改善痴呆小鼠的学习和记忆能力。
【关键词】：GSK3β Drp1 线粒体 阿兹海默综合症 学习与记忆
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 符号说明12-13
• 前沿13-15
• 实验材料15-23
• 实验方法23-32
• 实验结果32-37
• 讨论37-40
• 附图40-47
• 参考文献47-50
• 致谢50-51
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录51-52
• 学位论文评阅及答辩情况表52

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 Dragos Cīrneci;Radu Silaghi-Dumitrescu;;Learning tasks as a possible treatment for DNA lesions induced by oxidative stress in hippocampal neurons[J];Neural Regeneration Research;2013年32期

2 许美芬;何轶群;管敏鑫;;线粒体融合、分裂与神经变性疾病[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年12期

3 王雨o，

本文编号：741098