WISP1与TLRs激动剂在巨噬细胞中协同促炎机制的研究

发布时间：2017-08-27 08:04

  本文关键词：WISP1与TLRs激动剂在巨噬细胞中协同促炎机制的研究

  更多相关文章： WISP1 LPS Poly I:C 整合素 Toll样受体 巨噬细胞

【摘要】：背景： WISP1（CCN4）是Wnt/β-catenin信号通路激活后诱发转录的基因之一，其编码的蛋白属于CCN蛋白家族，具有多种调控功能，是连接细胞外基质及细胞信号传导的重要因子。CCN蛋白通过结合整合素受体激活信号通路，而整合素信号通路的激活在急性肺损伤中发挥重要作用。近来研究发现WISP1是机械通气诱导肺损伤的易感基因，而巨噬细胞在肺的炎症反应中具有重要作用。 目的： 本研究拟在巨噬细胞模型中探讨WISP1单独或与TLRs激动剂共同刺激对巨噬细胞炎症因子分泌的影响，以揭示WISP1在炎症发生中的作用机制，为WISP1介入治疗急性肺损伤提供新的理论基础。 方法： 首先在细胞水平，观察WISP1在炎症反应中的作用，通过ELISA检测细胞培养基中促炎因子TNF-α的水平，比较直接给予WISP1刺激或RGDs预处理阻断整合素通路后WISP1刺激对巨噬细胞分泌炎性因子的影响，，并通过免疫印迹检测下游信号因子p38MAPK、NF-κB的磷酸化水平，在分子水平探讨细胞内的信号传导机制。其次通过分离脂筏或免疫荧光的方法检测WISP1单独或与LPS共同刺激对TLR4受体复合物向脂筏募集过程的影响。再次，观察TLRs激动剂刺激对巨噬细胞中整合素表达水平影响，并通过TLR相关通路基因敲除小鼠（TLR4、CD14、TRIF）验证TLR通路的完整性对整合素表达的重要性。最后，观察WISP1与TLRs激动剂共同刺激巨噬细胞后，巨噬细胞炎症反应性的变化，明确WISP1-整合素信号通路与TLR通路间的相互影响在炎症反应中的作用。 结果： 1).WISP1单独刺激RAW264.7细胞后， p38MAPK，NF-κB（P65）的磷酸化水平增加，促炎因子TNF-α的分泌增加（P0.01）。RGDS预处理阻断整合素结合后，抑制TNF-α的分泌（P0.05）。表明整合素受体介导了WISP1的促炎作用。 2).WISP1增加MD2、整合素β3在脂筏分布。TLRs激动剂刺激原代腹腔巨噬细胞后，AKT、p38MAPK、NF-κB通路磷酸化水平增加,整合素β1，整合素β3的表达水平上调（P0.01），敲除TLR相关通路基因（TLR4、CD14、TRIF）后TLRs激动剂上调整合素表达的作用降低甚至消失。此结果表明TLRs炎性信号通路的激活可上调WISP1整合素受体的表达。 3).WISP1与TLRs激动剂共同刺激细胞后，TNF-α的水平较二者单独刺激明显增加（P0.05），RGDS预处理后，二者共同作用与单独刺激无明显差异。进一步证明整合素受体介导了WISP1与TLRs激动剂之间的协同促炎作用。 结论： WISP1通过与巨噬细胞表面整合素受体作用而激活p38MAPK及NF-κB炎性信号通路。WISP1通过整合素受体上调TLRs受体复合物的形成，从而增强TLRs激动剂增强炎症反应强度。而TLRs信号通路的激活反过来又增强整合素的表达，因此正反馈上调WISP1的促炎功能。这种正反馈弧的形成是WISP1在巨噬细胞中与TLRs激动剂协同促炎的机理。
【关键词】：WISP1 LPS Poly I:C 整合素 Toll样受体 巨噬细胞
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 目录7-10
• 第1章 引言10-13
• 第2章 材料与方法13-24
• 2.1 材料13-16
• 2.1.1 研究对象13
• 2.1.2 主要试剂与耗材13-15
• 2.1.3 主要仪器15-16
• 2.2 实验方法16-24
• 2.2.1 RAW264.7 细胞培养16-17
• 2.2.2 分离小鼠原代腹腔巨噬细胞17
• 2.2.3 Western Blot 实验17-21
• 2.2.4 TNF-αELISA 检测21-22
• 2.2.5 免疫荧光22
• 2.2.6 分离脂筏22-24
• 第3章 结果24-39
• 3.1 WISP1 与 TLRs 受体激动剂在 RAW264.7 巨噬细胞中的功能与机制研究24-29
• 3.1.1 WISP1 促进 RAW264.7 细胞分泌促炎细胞因子 TNF-α，RGDS 预处理阻断整合素通路后抑制 WISP1 促炎作用24-25
• 3.1.2 WISP1 激活 p38MAPK/NF-κB 通路25-26
• 3.1.3 WISP1 与 TLRs 激动剂 LPS 或 Poly I:c 共同作用具有协同增强细胞分泌促炎因子功能26-27
• 3.1.4 WISP1 增加 TLR4 受体复合物向脂筏的募集27-29
• 3.2 WISP1 与 TLRs 受体激动剂在小鼠原代腹腔巨噬细胞中的功能及机制研究29-39
• 3.2.1 WISP1 与 TLRs 激动剂 LPS 或 PolyI:c 共同刺激腹腔巨噬细胞后协同性增强细胞分泌促炎因子 TNF-α，RGDS 预处理阻断整合素通路后，协同作用消失29-31
• 3.2.2 TLR 相关基因（TLR4，CD14，TRIF）敲除后，WISP1 与 TLRs激动剂的协同作用明显减弱甚至消失31-32
• 3.2.3 WISP1 可低水平激活 p38MAPK/NF-κB 通路，但对细胞因子 TNF-α的分泌无明显影响32-33
• 3.2.4 原代腹腔巨噬细胞整合素β1 及β3 的水平明显低于 RAW264.7 细胞2433-34
• 3.2.5 TLRs 激动剂 LPS 或 PolyI:c 刺激腹腔巨噬细胞后，激活p38MAPK/NF-κB 通路后，上调整合素β1，β3 的表达34-36
• 3.2.6 TLR 相关基因（TLR4，CD14，TRIF）敲除后，TLRs 激动剂 LPS或 Poly I:C 刺激原代腹腔巨噬细胞后，整合素的表达水平增加幅度减低甚至消失36-37
• 3.2.7 TLRs 激动剂通过激活 p38MAPK/NF-kB-P65 通路上调整合素的表达并依赖于 TLR 通路的完整性37-39
• 第4章 讨论39-42
• 第5章 结论42-43
• 致谢43-44
• 参考文献44-46
• 个人简历 在读期间发表的学术论文与研究成果46-47
• 综述47-56
• 参考文献53-56

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本文编号：745025