肺炎链球菌Dnaj蛋白质的初步晶体学和功能研究

发布时间：2017-08-28 03:03

  本文关键词：肺炎链球菌Dnaj蛋白质的初步晶体学和功能研究

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【摘要】：背景肺炎链球菌是一种条件致病菌，已成为社区感染的重要病原菌之一。Dnaj属于肺炎链球菌的热休克蛋白40（HSP40）家族成员，在蛋白的折叠、转运等过程中扮演着重要的角色。该蛋白的活性位点及其作用机制，可以为我们寻找新的抗肺炎链球菌药物提供重要的信息。目前，肺炎链球菌的Dnaj蛋白的三维结构还没得到解析，其活性位点和作用机制仍然不清楚。 目的解析肺炎链球菌Dnaj蛋白的三维结构，找出其活性位点，通过功能实验，，了解其作用机制，为开发新型抗肺炎链球菌药物奠定基础。 方法将SpDnaj基因重组到PET28a载体上，构建PET28a-dnaj质粒，用大肠杆菌原核表达系统表达该蛋白，通过金属离子亲和层析柱（Ni-NAT）、阴离子交换层析柱（DEAE Sepharose Fast Flow）进行纯化，得到目的蛋白。用分子筛（Superdex200）分析蛋白在溶液中的聚集状态。用甲硫氨酸缺陷大肠杆菌Ecoli. B834表达硒代SpDnaj蛋白。坐滴气相扩散法和悬滴气相扩散法相结合，培养母体蛋白质和硒代蛋白质的晶体，X-射线衍射仪收集晶体衍射数据，再分别采用分子置换和多波长反常散射法解析晶体三维结构。根据三维结构选择蛋白定点突变的位点，再用等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry,ITC）和表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术结合蛋白质突变寻找蛋白与底物的结合位点，通过进一步的功能实验明确其活性位点和作用机制。 结果成功构建重组质粒PET28a-Dnaj，表达、纯化出纯度约85%的Dnaj蛋白质，该蛋白以四聚体形式存在于溶液中。表达、纯化出硒代Dnaj蛋白质。培养出晶型好、偏光能力强的母体蛋白质单晶、硒代蛋白质单晶以及SpDnaj和多肽P5-10复合物的晶体。在上海同步辐射光源收到母体、硒代蛋白质和复合物晶体的衍射数据以供解析结构使用。SpDnaj晶体属于空间群I222或I2_12_12_1，晶胞参数为a=47.68、b=104.45、c=234.57。根据SpDnaJ的分子量(约40kDa)和空间群，溶剂含量分析表明，每个晶体学不对称单位（per asymmetric unit）含一个蛋白质分子，提示一个V_M值3.24A~3Da~(-1)，对应的容积含量为62.08%。但是，分子置换和多波长反常散射方法都没能成功解析出蛋白质三维结构。ITC和SPR结果提示SpDnaj与多肽P5-10有结合。
【关键词】：肺炎链球菌 Dnaj 晶体 蛋白质肽复合物 三维结构
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R378.12
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 第一章 肺炎链球菌 Dnaj 蛋白质的结构和功能研究13-41
• 前言13-16
• 第一节 肺炎链球菌 Dnaj 蛋白的克隆、表达和纯化16-29
• 1 材料与方法16-25
• 2 结果25-28
• 3 讨论28-29
• 第二节 肺炎链球菌 Dnaj 的初步晶体学研究29-35
• 1 材料和方法29-31
• 2 结果31-33
• 3 讨论33-35
• 第三节 肺炎链球菌 Dnaj 功能的研究35-38
• 1 材料与方法35-37
• 2 结果37-38
• 3 讨论38
• 参考文献38-41
• 第二章 肺炎链球菌甘油脱氢酶的结构和功能研究41-53
• 第一节 肺炎链球菌 GldA 蛋白质的克隆、表达和纯化42-47
• 1 材料和方法42-44
• 2 结果44-46
• 3 讨论46-47
• 第二节 肺炎链球菌 GldA 的初步晶体学分析47-49
• 1 材料和方法47
• 2 结果47-48
• 3 讨论48-49
• 第三节 肺炎链球菌 GldA 的功能研究49-51
• 1.材料与方法49
• 2 结果49-50
• 3 讨论50-51
• 参考文献51-53
• 全文总结53-55
• 文献综述55-61
• 参考文献58-61
• 致谢61-62
• 攻读学位期间发表的学术论文及学术会议62-63

【参考文献】

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1 李月生;夏祥翔;李新怀;吕小婉;李耀会;李小定;;微量热技术在生命科学研究中的应用[J];化工时刊;2007年07期

2 符运良;傅军;吴英才;袁一方;;表面等离子共振传感技术的发展与应用[J];激光杂志;2006年06期

本文编号：747058