神经节苷脂GD2在大鼠骨髓间充质干细胞分离和鉴定研究中的应用

发布时间：2017-08-28 22:22

  本文关键词：神经节苷脂GD2在大鼠骨髓间充质干细胞分离和鉴定研究中的应用

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【摘要】：骨髓间充质干细胞(BM-MSCs),也称为骨髓基质干细胞,是骨髓中的一种成体干细胞,占骨髓来源单核细胞群的比例不到0.01%。一直以来由于没有找到理想的用于鉴定BM-MSCs的特异性标志,通常采用多种表面分子联合鉴定体外培养的BM-MSCs。最近一种新发现的表面分子神经节苷脂GD2,被用来鉴定人骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)和脐带间充质干细胞(UC-MSCs)等间充质干细胞。但大鼠BM-MSCs是否表达GD2还未见报道,本试验研究了大鼠BM-MSCs的GD2表达情况,为探索特异性分离、准确鉴定大鼠BM-MSCs提供新的技术途径；实验还应用percoll密度梯度离心法对大鼠BM-MSCs的分离方法进行了优化,都为获得可用于移植的高纯度BM-MSCs建立了技术平台。 实验一大鼠骨髓间充质干细胞表达神经节苷脂GD2的实验研究 研究方法：(1) BM-MSCs的分离和体外纯化培养：运用全骨髓贴壁法分离8-10周龄SD大鼠BM-MSCs,以1×109个/ml接种于含15%胎牛血清的a-MEM培养基,37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。(2)GD2合成酶mRNA表达的检测：以大鼠胚胎成纤维细胞(REFs)和小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)分别作为阴性和阳性对照,应用RT-PCR法检测第一代、第三代和第五代BM-MSCs的GD2合成酶mRNA表达情况。(3)BM-MSCs膜表面GD2的检测：应用细胞免疫组化法,检测第一代、第三代和第五代BM-MSCs表面GD2的表达。(4) BM-MSCs表面分子CD3、CD29、CD45、CD90表达的检测：应用流式细胞术检测第一代、第三代和第五代BM-MSCs表面分子群(CD3、CD2、CD45、CD90)的表达,对BM-MSCs表面分子群的表达结果与表面分子GD2流式检测结果进行比较分析。 结果：(1)BM-MSCs的培养与传代：全骨髓贴壁法培养BM-MSCs从原代培养到传代培养周期很长,需8-10d方可传代,以后传代培养周期缩短,每三天即可进行传代培养。(2) BM-MSCs GD2合成酶mRNA的表达：原代细胞中GD2合成酶mRNA表达较低,随着传一、二、三代,细胞内GD2合成酶mRNA表达量随之增加,之后再进行传代培养显示GD2合成酶mRNA表达处在一个稳定水平。REFs阴性表达GD2合成酶mRNA, B16F10阳性表达GD2合成酶mRNA。(3) BM-MSCs膜表面GD2分子表达：细胞免疫化学结果显示在第一代、第三代和第五代BM-MSCs的膜表面均表达GD2。(4) BM-MSCs表面分子群的表达：以流式细胞术检测BM-MSCs的表面分子群,CD90阳性细胞比率,第一、三、五代分别为59.2%、87.1%、98.2%；CD29阳性细胞比率,第一、三、五代分别为69%、80.9%、99.9%；CD45阳性细胞比率,第一、三、五代分别为13.8%、5.1%、1.1%；CD3阳性细胞比率,第一、三代分别为4.4%、0.8%；GD2阳性细胞比率,第-三、五、七代分别为87.3%、48.2%、36.2%、18.9%。 结论：(1)全骨髓贴壁法能成功分离培养大鼠BM-MSCs,体外培养的原代BM-MSCs和传一代、三代、五代的细胞内均表达GD2合成酶mRNA和膜表面GD2,与人和小鼠的研究结果一致,提示GD2种属间的保守性很高。(2)随着体外传代培养,细胞内GD2合成酶mRNA表达量呈递增变化而流式检测细胞表面分子GD2阳性细胞比率呈递减变化,GD2合成酶是GD2生物合成过程中的一种限速酶,由于BM-MSCs从体内到体外环境的改变,GD2合成酶在mRNA水平表达量增高并没有提高膜表面GD2分子阳性细胞比率其具体调节机制有待进一步研究。(3)体外传代培养大鼠BM-MSCs过程中,膜表面分子GD2阳性细胞比率呈递减变化,说明体外培养的BM-MSCs表面分子GD2的表达逐渐减少,与文献报道的GD2可以作为鉴定人和小鼠早期MSCs的特异性标志一致。(4)随着传代纯化培养的进行,通常用于联合鉴定的表面分子CD90、CD45阳性细胞比率呈递增变化,到第五代时CD90、CD45双阳性细胞比率达98%,细胞纯度高,可用于后续试验研究。 实验二应用神经节苷脂GD2分离和鉴定大鼠骨髓间充质干细胞 研究方法：(1)采用Percoll密度梯度离心法分离培养大鼠BM-MSCs, RT-PCR检测不同密度梯度层细胞(1.0448g/ml、1.0578g/ml、1.0708g/ml、1.0838g/ml、1.0968g/ml)GD2合成酶mRNA的表达,确定BM-MSCs所处的密度层,为快速获得BM-MSCs提供依据。(2)对密度梯度离心法分离获得的BM-MSCs进行体外培养,观察细胞的形态及生长特性,采用四甲基噻哗蓝(MTT)比色试验检测细胞活力,绘制生长曲线,并与全骨髓贴壁法培养的细胞活力进行比较。(3)应用流式细胞术检测密度梯度离心分离得到的BM-MSCs表面分子群(CD3、CD29、CD45、CD90)的表达,检测其纯度。 结果：(1)RT-PCR试验结果显示,仅在1.0708g/ml这一密度层的细胞有GD2合成酶mRNA的表达。(2)密度梯度离心得到的细胞接种后,刚开始增殖慢,适应一段时间后,经6-7d原代培养后即可进行传代培养,传代培养的周期为2-3d,与全骨髓贴壁法传代培养的周期相近。MTT检测发现传代后的细胞活力较高,对数生长期的细胞在接种后15h左右。(3)密度梯度离心获得的细胞经体外培养,流式细胞检测一代细胞表面分子CD90、CD29、CD45、CD3阳性细胞比率分别为88.5%、99.9%、0.2%、0.1%,其纯度高于全骨髓贴壁法获得的一代细胞。 结论：Percoll密度梯度离心法能够快速获得BM-MSCs,离心过程中细胞受到一定损伤,接种培养后发现贴壁所需的时间较贴壁分离法长,一般原代培养6-7d可进行传代培养。传代后的细胞活力增高,增殖快；流式细胞检测密度梯度获得的传一代BM-MSCs表面分子群CD3、CD29、CD45、CD90阳性细胞比率比全骨髓贴壁法获得的一代细胞的纯度高。传一代后细胞形态趋于一致,采用MTT比色检测密度梯度离心获得的一代、二代、三代生长良好的细胞活力,绘制生长曲线,与全骨髓贴壁法培养的一代、二代、三代细胞进行比较。密度梯度离心得到的细胞活力高于全骨髓贴壁法,且密度梯度离心培养的细胞对数生长期在接种后的15h左右,相比贴壁细胞的24h,其增殖周期缩短,细胞活力高。
【关键词】：大鼠 骨髓间充质干细胞 双唾液酸神经节苷脂 鉴定 密度梯度离心
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-9
• 目录9-10
• 符号说明10-11
• 文献综述11-26
• 1. 神经节苷脂11-16
• 1.1 神经节苷脂的结构和分布11
• 1.2 神经节苷脂的生物学功能11-12
• 1.3 神经节苷脂在神经系统发育过程中的作用12-13
• 1.4 神经节苷脂与神经疾病13
• 1.5 神经节苷脂与肿瘤疾病13-14
• 1.6 神经节苷脂是一些神经细胞特有标记物14-15
• 1.7 GD2的生物学特性15-16
• 2. 骨髓间充质干细胞16-20
• 2.1 BM-MSCs概述16
• 2.2 BM-MSCs的形态特征16-17
• 2.3 BM-MSCs的分化潜能17-18
• 2.4 BM-MSCs的分离和培养18
• 2.5 BM-MSCs的鉴定18-20
• 参考文献20-26
• 研究论文26-55
• 第一章 大鼠骨髓间充质干细胞表达神经节苷脂GD2的研究26-48
• 1. 实验材料26-29
• 2. 实验方法29-35
• 3. 结果35-46
• 4. 讨论46-48
• 第二章 应用神经节苷脂GD2分离鉴定大鼠骨髓间充质干细胞48-55
• 1. 实验材料48
• 2. 实验方法48-50
• 3. 结果50-53
• 4. 讨论53-55
• 全文结论55-56
• 参考文献56-58
• 致谢58-59
• 攻读学位期间发表的学术论文目录59-60

【参考文献】

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1 邱丽燕,王金福;骨髓间充质干细胞的研究进展[J];生物工程学报;2003年02期

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本文编号：749802