人羊膜上皮细胞的干细胞特性及其在不同浓度维甲酸诱导下分化为神经样细胞的研究

发布时间：2017-08-29 14:03

  本文关键词：人羊膜上皮细胞的干细胞特性及其在不同浓度维甲酸诱导下分化为神经样细胞的研究

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【摘要】：目的：1.建立人羊膜上皮细胞(HAECs)的分离培养体系,对人羊膜上皮细胞进行分离、培养、鉴定、纯化及扩增。2.探索人羊膜上皮细胞的胚胎干细胞和神经干细胞特性,研究其诱导分化为神经样细胞的潜能。3.探索维甲酸诱导人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞的最优浓度。方法：1.人羊膜清洗剪碎后先经0.25%Ⅱ型胶原酶消化2小时,然后经0.25%胰酶/0.02%EDTA消化15min后,将细胞悬液以1×107个/ml的密度接种到25ml培养瓶中,倒置相差显微镜动态观察细胞变化：免疫组化和免疫荧光方法鉴定贴壁细胞是否为人羊膜上皮细胞。2.采用免疫组化方法鉴定胚胎干细胞特异性标记SSEA-4,0ct-4和神经干细胞特异性标记nestin和musashi在体外培养的人羊膜上皮细胞(HAECs)中的表达情况。3.实验组使用不同浓度(1×10-8M、1×10-7M、1×10-6M、1×10-5M)的维甲酸在体外诱导人羊膜上皮细胞(HAECs),未加入维甲酸干预的为对照组。7天后,采用免疫组化、western-blotting、RT-PCR检测细胞胚胎干细胞特异性标记Oct-4、神经干细胞特异性标记nestin、神经元特异性标记MAP-2和胶质细胞特异性标记GFAP的表达情况,实验结果采用SPSS17.0统计软件进行分析。结果：1.倒置相差显微镜观察到分离的细胞2-3天后贴壁,之后细胞逐渐变大,折光性降低,整个细胞轮廓变暗,完全伸展的细胞形态多样,呈梭形、多角形、眼睛样等,轮廓清晰,胞浆丰富,胞核呈圆形、卵圆形,核居中。3d后,人羊膜上皮细胞进入指数生长期,细胞数量明显增多,呈不规则的多角形,5d-7d左右90%细胞融合成片,形成单层放射状或漩涡状生长。细胞免疫组化和免疫荧光显示全部的贴壁细胞内上皮细胞特异性标记物CK19表达强阳性,而间质细胞特异性标记物vimentin仅在部分细胞内弱阳性表达。2.体外培养的人羊膜上皮细胞内胚胎干细胞特异性标记SSEA-4, Oct-4和神经干细胞特异性标记nestin和musashi表达阳性3.细胞免疫组化、蛋白印迹技术和Real-time PCR结果免疫组化结果：与对照组相比,实验组中胚胎干细胞标记Oct-4表达降低,神经干细胞特异性标记nestin、神经元特异性标记MAP-2和胶质细胞特异性标记GFAP的表达升高；各实验组相比较,随着维甲酸浓度的升高,胚胎干细胞标记Oct-4表达逐渐降低,神经干细胞特异性标记nestin、神经元特异性标记MAP-2和胶质细胞特异性标记GFAP的表达逐渐升高。实验组中加入10-5M的维甲酸诱导后细胞胞浆内出现空泡样改变,大量细胞固缩脱落,并可见部分细胞碎片。蛋白印迹结果：随着维甲酸浓度增高,Nestin, MAP-2和GFAP在蛋白水平表达逐渐增高,而OCT-4蛋白表达逐渐降低。与对照组比较,实验组nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表达均明显增加,并有统计学差异(P0.05)。实验组中1×10-7M较1×10-8 M nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表达增多,且有统计学差异(p0.05)；1×10-6M较1×10-7 Mnestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表达增多,且有统计学差异(p0.05)；1×10-5M较1×10-6M nestin蛋白、MAP-2蛋白和GFAP蛋白表达增多,但无统计学差异(p0.05)。与对照组比较,实验组Oct-4蛋白表达均明显降低,且具有统计学差异(P0.05)。实验组中1×10-7M较1×10-8 M Oct-4蛋白表达降低,且有统计学差异(p0.05)；1×10-6M较1×10-7 MOct-4蛋白表达降低,且有统计学差异(p0.05)；1×10-5M较1×10-6 M Oct-4蛋白表达降低,但无统计学差异(p0.05)。Real-time PCR结果：与对照组比较,实验组nestin mRNA、MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表达均明显增加,并有统计学差异(P0.05)。实验组中1×10-7M较1×10-8 Mnestin mRNA、MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表达增多,且有统计学差异(p0.05)：1×10-6 M较1 × 10-7 M nestin mRNA,MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表达增多,且有统计学差异(p0.05)；1×10-5M较1×10-6M nestin mRNA、MAP-2 mRNA和GFAP mRNA表达增多,但无统计学差异(p0.05)。与对照组比较,实验组Oct-4 mRNA表达均明显降低,且具有统计学差异(P0.05),实验组中1×10-7 M较1×10-8 M Oct-4 mRNA表达降低,且有统计学差异(p0.05)；1×106-M较1×10-7 M Oct-4 mRNA表达降低,且有统计学差异(p0.05)：1×10-5M较1×10-6 M Oct-4 mRNA表达降低,但无统计学差异(p0.05)。结论：1.体外成功完成人羊膜上皮细胞的分离、培养、鉴定、纯化和扩增。2.人羊膜上皮细胞能够表达胚胎干细胞和神经干细胞的特异性标志,具有胚胎干细胞和神经干细胞特性,并可能具有向神经样细胞分化的潜能。3.人羊膜上皮细胞能够被维甲酸诱导为神经样细胞,维甲酸浓度与诱导分化程度呈剂量依赖关系,1×10-5M的维甲酸使人羊膜上皮细胞死亡细胞比例明显升高,1×10-6M的维甲酸浓度是诱导人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞的最适宜浓度。
【关键词】：人羊膜上皮细胞 干细胞 维甲酸 细胞治疗 诱导分化
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10-13
• 第一部分：人羊膜上皮细胞的分离、培养及鉴定13-21
• 一、主要实验材料13-14
• 二、实验方法14-16
• 三、结果16-17
• 四、讨论17-18
• 五、结论18-19
• 附图19-21
• 第二部分：人羊膜上皮细胞生物学特性的鉴定21-25
• 一、主要材料与仪器21
• 二、实验方法21
• 三、实验结果21
• 四、讨论21-23
• 五、结论23-24
• 附图24-25
• 第三部分：人羊膜上皮细胞经不同浓度维甲酸诱导分化为神经样细胞的实验研究25-39
• 一、主要实验材z125-27
• 二、实验方法27-29
• 三、结果29-30
• 四、讨论30-32
• 五、结论32-33
• 附图33-39
• 参考文献39-41
• 综述41-46
• 参考文献44-46
• 致谢46-47

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本文编号：753658