脐带间充质干细胞移植前细胞活性评价指标的研究

发布时间：2017-08-29 16:06

  本文关键词：脐带间充质干细胞移植前细胞活性评价指标的研究

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【摘要】：背景： 人脐带来源间充质干细胞（human umbilical cord derived mesenchymal stemcells, hUC-MSCs）凭借其组织来源广泛、含量丰富、不受伦理限制等优势成为间充质干细胞的理想来源,是目前干细胞移植的热点。UC-MSCs作为一种动态的活细胞，移植前细胞活性对治疗效果的影响最为直接。目前移植前细胞活性检测指标通常采用经典台盼蓝染色法。但是由于易受主观因素的影响，并且其检测针对的是细胞膜完整性，仅仅是细胞生理状态的一部分，并不能时时地准确反映细胞整体功能，从而影响对临床应用的指导意义。因此，探寻一种可准确反映细胞功能状态的活性指标，将会大大促进间充质干细胞在临床疾病治疗、科学研究方面的发展。 目的： 通过对多种具有代表性的细胞活性测定方法进行比较，探寻可准确反映细胞功能状态的活性指标，筛选出一定条件下能够真实反映移植前细胞状态的活性指标，为UC-MSCs临床应用提供指导。 方法： 1.体外分离培养人脐带间充质干细胞，细胞免疫学表型鉴定，成骨成脂诱导； 2.UC-MSCs的保存：0.9%氯化钠注射液，4℃条件下保存0h、2h、4h、6h； 3.评估人工活性测定方法（台盼蓝法、TUNEL、Live-Dead Assay、贴壁实验）的准确性； 4.采用多种具有代表性的细胞活性测定方法（台盼蓝染色法、Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验）检测保存后细胞存活率； 5.对细胞存活率与反应细胞功能状态指标CFE进行相关性分析； 6.对贴壁实验在不同观察者之间的可靠性进行统计学分析。 结果： 1.针对0.9%生理盐水保存不同时间点（0h、2h、4h、6h）的UC-MSCs进行活性检测，，人工检测方法（台盼蓝染色法、TUNEL、Live-Dead Assay、贴壁实验）之间最大测量差值大约分别是1.46%、6.89%、8.23%、8.94%，均小于10%的统计误差； 2.在UC-MSCs保存0h时，台盼蓝染色法同其它几种经典活性测定方法（Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-DeadAssay、贴壁实验）比较，结果相似，差异无统计学意义，而对于保存一定时间后UC-MSCs，细胞活力则具有显著性差异； 3.观察保存后细胞存活率与反应其功能状态指标CFE之间的关联程度，采用台盼蓝染色法测得的活细胞比例与CFE的相关性为r2=0.893，而其它的检测方法（Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-DeadAssay、贴壁实验）测得的活细胞比例与CFE则具有较好的的相关性（分别为r2=0.935、0.949、0.924、0.947、0.982），其中贴壁实验的相关系数最高； 4.贴壁实验作为一种人工活性检测方法，其结果的可靠性存在争议。采用其进行活力分析时，5个观察者测得的活性数据不存在显著性差异，具有较好的一致性。 结论： 1.采用几种经典测定方法（台盼蓝染色法、Annexin V-PI、TUNEL、CCK-8、Live-Dead Assay、贴壁实验）检测细胞活力时，台盼蓝染色法适用于即刻细胞活力的检测； 2.对于经过保存之后的细胞，台盼蓝法过高的估计了细胞功能，其他活性检测方法则可以较之相对精确，而其中贴壁实验则是目前众多检测细胞活性方法中相对较为精确的； 3.观察者的差异性并不会影响贴壁实验结果的可靠性。
【关键词】：间充质干细胞 细胞移植 细胞活性 克隆形成率
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 英文缩略词表12-13
• 前言13-15
• 第一章 材料与方法15-30
• 1.1 实验材料15-22
• 1.1.1 脐带来源15
• 1.1.2 主要实验试剂15-16
• 1.1.3 主要实验耗材16-17
• 1.1.4 主要仪器17-18
• 1.1.5 溶液配制18-22
• 1.2 实验方法22-30
• 1.2.1 脐带标本的采集22
• 1.2.2 UC-MSCs 的制备22
• 1.2.3 UC-MSCs 的原代、传代培养及细胞冻存22-23
• 1.2.4 细胞计数23-24
• 1.2.5 UC-MSCs 的鉴定24-25
• 1.2.6 UC-MSCs 的保存25
• 1.2.7 保存后 UC-MSCs 活性测定25-29
• 1.2.8 UC-MSCs 克隆形成能力的检测29
• 1.2.9 统计学分析29-30
• 第二章 实验结果30-43
• 2.1 UC-MSCs 原代培养细胞生长情况及光镜下形态30
• 2.2 UC-MSCs 鉴定结果30-34
• 2.3 不同人工活性检测方法测定经保存 UC-MSCs 存活率34
• 2.4 不同检测方法对 UC-MSC 保存不同时间点测得的细胞活性比较34-35
• 2.5 不同检测方法对经保存 UC-MSCs 活性分析与集落形成率的比较35-42
• 2.6 评估贴壁实验的可靠性42-43
• 第三章 讨论43-47
• 参考文献47-52
• 综述52-70
• 参考文献59-70
• 发表文章70-71
• 致谢71-72
• 个人简介72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 张曦;陈幸华;司英健;刘耀;高蕾;高力;张诚;彭贤贵;王庆余;;人脐血源基质细胞移植促进裸鼠造血损伤修复的实验研究[J];重庆医学;2007年17期

2 高力;张曦;高蕾;陈幸华;;不同来源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞增殖和凋亡的影响[J];第三军医大学学报;2009年10期

3 刘阳;赖翼;李敏惠;杨淑霞;郑静;阳泰;李丽梅;邓勇;张强;任荣梅;李钱梅;张帅;邹强;李华;;流式细胞术检测细胞存活率的方法学建立[J];国际检验医学杂志;2011年15期

4 孙国栋;李志忠;王晶;林永新;洪亮;吴波文;焦根龙;邵建立;;人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究[J];西安交通大学学报(医学版);2010年02期

5 孙晓娟;杨乃龙;;成人与胎儿骨髓间充质干细胞生物学性状的比较[J];中国组织工程研究与临床康复;2009年14期

6 王

本文编号：754180