RbAp48和PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究

发布时间：2017-08-30 08:09

  本文关键词：RbAp48和PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究

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【摘要】：细胞分化与去分化是生命科学领域中的研究热点之一,对其机制的研究可以为肿瘤的发生及防治提供重要的依据。红细胞分化是一个受到很多特定蛋白质调控的十分精细的过程。在体外诱导剂的存在下,小鼠白血病MEL细胞可以向正常红系分化方向分化,逐渐表达血红蛋白,最后变成正常或接近于正常的细胞。丁酸钠是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,它能够通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性,增强组蛋白的乙酰化水平,从而促进基因的转录。研究发现丁酸钠能够抑制MEL细胞的增殖活力,诱导细胞向红系方向分化,促使细胞表达血红蛋白、血型糖蛋白A等红系相关标志蛋白。在丁酸钠处理MEL细胞72h后,分化细胞的比例达到平台期80%左右。此前,我们利用丁酸钠诱导MEL细胞分化作为红系分化模型,发现RbAp48蛋白和PBDC1蛋白的表达量在MEL细胞分化过程中分别是上调和下调,由此推测这两个蛋白可能与红系分化有关。 RbAp48是一个定位于细胞核的组蛋白结合蛋白,在小鼠各种组织中均有表达。在丁酸钠诱导MEL细胞分化的过程中,RbAp48的表达水平逐渐上调,且在丁酸钠处理72h和96h后,其表达量达到分化前的1.5倍左右。同时,红系转录因子GATA-1的表达水平在丁酸钠处理72h之前也是逐渐上调的,而增殖相关蛋白c-Myc的表达水平逐渐下调。GATA-1通过与基因启动子中的(A/T)GATA(A/G)模序结合,从而激活造血特异基因。此外,c-Myc表达与肿瘤细胞的生长速度以及分化程度相关,在增殖速度较慢和分化程度较高的肿瘤细胞中表达降低更为显著。这表明RbAp48, GATA-1和c-Myc可能共同参与了红系细胞分化。 免疫荧光实验研究发现在分化早期RbAp48主要定位于细胞核,在丁酸钠处理MEL细胞72h和96h后,较多的RbAp48存在于细胞质中,且每个细胞RbAp48的平均荧光强度达到分化前的1.7倍左右。为进一步研究RbAp48在MEL细胞分化中的作用,我们利用RNAi的方法构建了低表达RbAp48的MEL细胞稳定株。联苯胺染色结果表明,对照组的MEL细胞在丁酸钠处理72h后分化比例达到83%,而低表达RbAp48的MEL细胞在丁酸钠处理72h后分化比例只有63%,即分化能力下降了20%左右。这表明RbAp48的高表达对于MEL细胞分化是必需的。这些结果为RbAp48与MEL细胞分化之间的关系提出了新的认识,对阐明红系细胞终末分化的机制具有重要的理论意义。 由于PBDC1是一个新发现的蛋白,有关它的特性及功能尚不了解,而且还没有商品化的PBDC1抗体。为了研究它在MEL细胞分化中的功能,本研究利用原核表达载体pET-28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中大量表达PBDC1融合蛋白,通过镍离子亲和层析纯化该蛋白,并以此免疫新西兰大白兔制备抗血清,经蛋白A柱纯化后得到抗PBDC1蛋白的多克隆抗体。利用该抗体研究发现PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化过程中逐渐下调。因此,本研究制备的PBDC1抗体为进一步研究PBDC1在红系分化中的功能提供了有利工具。此外,利用荧光定量PCR技术研究发现PBDC1mRNA的表达水平在丁酸钠诱导MEL分化过程中也是逐渐下调。综上所述,在MEL细胞分化过程中,我们发现PBDC1在基因水平和蛋白水平都是逐渐下调的,由此推测PBDC1可能是MEL细胞红系分化的调控因子。PBDC1功能的相关研究工作还在继续开展中。
【关键词】：RbAp48 PBDC1 红系分化 MEL细胞 丁酸钠 多克隆抗体
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略表8-9
• 目录9-12
• 第一章 绪论12-18
• 1 红细胞分化12-13
• 2 RbAp48蛋白的研究现状13-15
• 3 PBDC1蛋白简介15
• 4 大肠杆菌表达系统15-16
• 5 研究目的及意义16-17
• 6 技术路线和方法17-18
• 第二章 RbAp48在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究18-46
• 1 前言18
• 2 材料与方法18-34
• 2.1 材料18-22
• 2.1.1 细胞、菌株和质粒18
• 2.1.2 仪器18-19
• 2.1.3 试剂19-20
• 2.1.4 主要试剂的配制20-22
• 2.2 方法22-34
• 2.2.1 细胞培养22
• 2.2.2 联苯胺染色检测丁酸钠诱导MEL细胞向红系方向分化22
• 2.2.3 MTT比色法检测丁酸钠对MEL细胞活力的影响22
• 2.2.4 半定量PCR法检测红系相关基因在MEL细胞分化中的表达情况22-25
• 2.2.4.1 半定量PCR引物设计22-23
• 2.2.4.2 细胞总RNA的提取23
• 2.2.4.3 RNA的反转录23-24
• 2.2.4.4 半定量PCR检测红系相关基因的表达情况24-25
• 2.2.5 瑞氏染色25
• 2.2.6 Western blot检测RbAp48在MEL细胞分化中的表达变化25-26
• 2.2.7 Western blot检测GATA-1和c-Myc在MEL细胞分化中的表达变化26
• 2.2.8 Western blot检测RbAp48在小鼠胎肝发育过程中的表达情况26
• 2.2.9 Western blot分析RbAp48的小鼠组织表达谱26
• 2.2.10 免疫荧光实验检测RbAp48在MEL细胞分化过程中的细胞定位26-27
• 2.2.11 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的构建27-32
• 2.2.11.1 pLKO.1-TRC载体的实验室应用27-28
• 2.2.11.2 shRNA寡核苷酸序列的设计28
• 2.2.11.3 寡核苷酸片段的退火28
• 2.2.11.4 pLKO.1-TRC质粒的小量提取28-29
• 2.2.11.5 pLKO.1-TRC质粒的双酶切29-30
• 2.2.11.6 pLKO.1-TRC与退火的寡核苷酸片段连接30
• 2.2.11.7 E.coli DH5α感受态细胞的制备30
• 2.2.11.8 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞30-31
• 2.2.11.9 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的双酶切鉴定31
• 2.2.11.10 测序鉴定31-32
• 2.2.12 慢病毒的包装32-33
• 2.2.12.1 质粒的大抽32
• 2.2.12.2 病毒包装32-33
• 2.2.13 低表达RbAp48的MEL细胞稳定株的建立33
• 2.2.14 Western blot检证低表达RbAp48的MEL细胞稳定株33
• 2.2.15 低表达RbAp48对丁酸钠诱导MEL细胞红系分化能力的影响33-34
• 3 结果34-43
• 3.1 丁酸钠诱导MEL细胞向红系方向分化34-36
• 3.1.1 联苯胺染色检测血红蛋白的表达34
• 3.1.2 联苯胺阳性细胞的统计34-35
• 3.1.3 丁酸钠抑制了MEL细胞生长活力35
• 3.1.4 α-globin,β-globin,and GPA mRNA在MEL细胞分化过程中逐渐上调35-36
• 3.2 瑞氏染色检测表明MEL细胞分化后出现核固缩36
• 3.3 RbAp48在MEL细胞分化过程中逐渐上调36-37
• 3.4 c-Myc在MEL细胞分化过程中逐渐下调,GATA-1在分化早期上调37
• 3.5 RbAp48在小鼠胎肝发育过程中逐渐上调37-38
• 3.6 RbAp48在小鼠不同组织中广泛表达38
• 3.7 RbAp48在MEL分化过程中的亚细胞定位38-39
• 3.8 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的鉴定39-40
• 3.8.1 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的双酶切鉴定39-40
• 3.8.2 干扰载体pLKO.1-RbAp48-shRNA的测序鉴定40
• 3.9 病毒包装时转染效率的检测40-41
• 3.10 低表达RbAp48的MEL细胞稳定株的筛选41
• 3.11 Western blot鉴定低表达RbAp48的MEL细胞稳定株41-42
• 3.12 低表达RbAp48抑制了丁酸钠诱导MEL细胞的红系分化能力42-43
• 4 讨论43-46
• 第三章 PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究46-63
• 1 前言46
• 2 材料与方法46-56
• 2.1 材料46-48
• 2.1.1 细胞株、菌株及质粒46
• 2.1.2 仪器46-47
• 2.1.3 试剂47
• 2.1.4 主要试剂的配制47-48
• 2.2 方法48-56
• 2.2.1 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的构建48-51
• 2.2.1.1 pET-28a(+)载体的实验室应用48-49
• 2.2.1.2 MEL细胞中总RNA的提取49
• 2.2.1.3 RNA的反转录49
• 2.2.1.4 PBDC1基因的引物设计49-50
• 2.2.1.5 PBDC1基因的克隆50
• 2.2.1.6 pET-28(+)质粒的提取50
• 2.2.1.7 PBDC1基因与pET-28a(+)质粒连接50-51
• 2.2.1.8 E.coli BL21(DE3)感受态细胞的制备51
• 2.2.1.9 连接产物转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞51
• 2.2.2 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的鉴定51-53
• 2.2.2.1 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的PCR鉴定51-52
• 2.2.2.2 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的双酶切鉴定52-53
• 2.2.2.3 重组pET-28a(+)-PBDC1质粒的测序鉴定53
• 2.2.3 PBDC1蛋白的表达、纯化及鉴定53-54
• 2.2.3.1 PBDC1蛋白的表达53
• 2.2.3.2 PBDC1蛋白的纯化53-54
• 2.2.3.3 PBDC1蛋白的质谱鉴定54
• 2.2.4 PBDC1多克隆抗体的制备、纯化及鉴定54-55
• 2.2.4.1 PBDC1多克隆抗体的制备54
• 2.2.4.2 PBDC1多克隆抗体的纯化54
• 2.2.4.3 PBDC1多克隆抗体的ELISA检测54-55
• 2.2.4.4 PBDC1多克隆抗体的Western blot检测55
• 2.2.5 Western blot检测PBDC1在MEL细胞分化中的表达变化55
• 2.2.6 Real-time PCR检测PBDC1在MEL细胞分化中的表达变化55-56
• 2.2.6.1 荧光定量PCR引物的设计55
• 2.2.6.2 细胞总RNA的提取55
• 2.2.6.3 RNA反转录55
• 2.2.6.4 实时定量PCR55-56
• 3 结果56-62
• 3.1 PCR扩增PBDC1基因56-57
• 3.2 重组质粒pET-28a(+)-PBDCl的鉴定57-58
• 3.2.1 重组质粒pET-28a(+)-PBDC1的PCR鉴定和双酶切鉴定57
• 3.2.2 重组质粒pET-28a(+)-PBDC1的测序鉴定57-58
• 3.3 PBDC1蛋白的表达及可溶性分析58-59
• 3.4 PBDC1蛋白的纯化及鉴定59
• 3.5 PBDC1多克隆抗体的ELISA检测59-60
• 3.6 PBDC1多克隆抗体的Western blot检测60
• 3.7 PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中逐渐下调60
• 3.8 PBDC1 mRNA在丁酸钠诱导MEL细胞分化中逐渐下调60-62
• 4 讨论62-63
• 第四章 结论和展望63-65
• 1 结论63-64
• 1.1 RbAp48在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究63
• 1.2 PBDC1在丁酸钠诱导MEL细胞分化中的功能研究63-64
• 2 展望64-65
• 参考文献65-68
• 致谢68-69
• 攻读学位期间的研究成果69

【共引文献】

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1 王昊;周东勋;周华邦;汪慧;涂芊茜;胡和平;;肝癌组织中多种自体吞噬的形态测量学分析[J];第二军医大学学报;2011年03期

2 李莲莲;陈若翰;陈淑珍;甄永苏;古维立;蔡冬青;崔耀隆;李嘉豪;;抗凋亡蛋白BRE、TNFR1和自体吞噬蛋白Beclin1在小鼠肝纤维化的表达及Reversine对其的影响[J];广东医学;2011年15期

3 魏s，

本文编号：758166