重组人巨细胞病毒外被蛋白基因的表达

发布时间：2017-08-30 07:38

  本文关键词：重组人巨细胞病毒外被蛋白基因的表达

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【摘要】：人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)是一种以业临床性感染或潜伏性感染为主要感染方式的病毒。HCMV能严重危害孕妇和胎儿以及免疫力低下的个体,并且在世界范围内其感染性普遍存在。抗HCMV药物可针对相关性疾病起到阶段性改善作用,但存在毒副作用和耐药性等缺陷,使得抗HCMV疫苗的研发更具有意义。评价抗HCMV疫苗的理想程度是根据其所包含的具有免疫作用的抗原成分。理想的抗原成分可诱导广谱的中和抗体反应和细胞毒性T淋巴细胞反应,对初次感染的预防有显著作用,且对HCMV感染率与发病率有很好的控制效果,并解决了安全性与耐受性的问题。HCMV是一种胞内感染病毒,只有通过细胞免疫才能将其完全清除。常规的预防性疫苗主要是针对未感染的个体,诱导其有效的免疫应答,对已感染的个体不起作用。因此,研发可清除病原体与感染细胞的治疗性疫苗具有更深远的意义。外被磷蛋白65(Phosphoprotein65, pp65)和包膜糖蛋白B(Glycoprotein B, gB)在介导HCMV感染和病毒复制过程中发挥重要的作用,pp65是诱导机体产生细胞免疫的主要抗原,而gB是诱导机体产生体液免疫的主要抗原。 本研究将pp65与gB抗原表位基因通过重叠延伸PCR融合,获得融合基因pp65362-504-gB607-621,构建重组表达载体pFLAG-ATS-pp65362-504-gB607-621并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,通过诱导条件的改变未获得可溶性融合蛋白。为了实现融合蛋白的可溶性表达,利用Bac-to-Bac系统进行目的蛋白的表达。本研究构建了一个同时编码报告基因增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和带有6个组氨酸标签片段的融合基因的载体pFastBacTMual-EGFP-pp65362-504-gB607-621,两个基因片段分别控制于p10和PH启动子,双酶切反应和测序验证重组质粒构建正确。将重组质粒转化E. coil DH1OBac发生定点转座产生重组杆粒bacmid-EGFP-pp65362-504-gB607-621,PCR验证其构建正确。采用脂质体转染试剂将重组杆粒转入昆虫细胞系Sf9中,扩增获得的杆状病毒感染Sf9昆虫细胞表达融合蛋白。通过SDS-PAGE和Western Blot对融合蛋白的表达进行检测。结果证明融合蛋白在昆虫细胞可溶性表达并能够与抗体发生特异的反应。
【关键词】：人巨细胞病毒 外被磷蛋白65 包膜糖蛋白B 可溶性表达
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373;Q78
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 引言10-11
• 1 文献综述11-22
• 1.1 人巨细胞病毒(HCMV)11-14
• 1.1.1 HCMV生物学特征11-12
• 1.1.2 HCMV流行病学12-13
• 1.1.3 HCMV致病机制13
• 1.1.4 HCMV所致疾病13-14
• 1.2 人体抗HCMV感染机制14-17
• 1.2.1 机体针对HCMV的体液免疫14-16
• 1.2.2 机体针对HCMV的细胞免疫16-17
• 1.3 HCMV的防治17-20
• 1.3.1 抗HCMV药物17
• 1.3.2 HCMV疫苗17-18
• 1.3.3 gB在HCMV疫苗中的研究18-20
• 1.3.4 pp65在HCMV疫苗中的研究20
• 1.4 本课题的研究思路及主要研究内容20-22
• 2 重组HCMV外被蛋白基因在大肠杆菌中的表达22-35
• 2.1 引言22
• 2.2 实验材料、试剂和仪器22-24
• 2.2.1 实验仪器22-23
• 2.2.2 实验试剂23-24
• 2.3 实验方法24-31
• 2.3.1 HCMVpp65_(362-504)-gB_(607-621)基因的获得24-26
• 2.3.2 pFLAG-ATS-pp65_(362-504)-gB_(607-621)载体的构建26-29
• 2.3.3 重组质粒的诱导表达29-30
• 2.3.4 SDS-PAGE检测HCMV外被融合蛋白表达30-31
• 2.4 实验结果与讨论31-33
• 2.4.1 PCR扩增HCMV目的基因片段31-32
• 2.4.2 pFLAG-ATS-pp65_(362-504)-gB_(607-621)重组质粒的构建与鉴定32
• 2.4.3 重组HCMV外被蛋白在大肠杆菌中的表达32-33
• 2.5 讨论33-34
• 2.6 小结34-35
• 3 重组HCMV外被蛋白基因在昆虫细胞中的表达35-54
• 3.1 引言35
• 3.2 实验材料35-37
• 3.2.1 实验仪器35-36
• 3.2.2 实验试剂36-37
• 3.3 实验方法37-45
• 3.3.1 HCMVpp65_(362-504)-gB_(607-621)基因的获得37-38
• 3.3.2 pFastBac~(TM)Dual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)载体的构建38-41
• 3.3.3 重组杆粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的构建41-42
• 3.3.4 重组杆粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的转染42-43
• 3.3.5 重组HCMV外被蛋白基因在昆虫细胞中的表达43
• 3.3.6 SDS-PAGE检测表达蛋白质43
• 3.3.7 Western Blot检测昆虫细胞表达目的蛋白质43-44
• 3.3.8 昆虫细胞表达目的蛋白质的纯化44-45
• 3.3.9 昆虫细胞表达目的蛋白质加入病毒量的优化45
• 3.4 实验结果45-51
• 3.4.1 HCMV pp65_(362-504)-gB_(607-621)融合基因PCR扩增45-47
• 3.4.2 pFastBacTMDual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)载体的构建与鉴定47
• 3.4.3 重组杆粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的构建47-48
• 3.4.4 重组杆粒bacmid-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)的转染48
• 3.4.5 重组HCMV外被蛋白基因在昆虫细胞中的表达48-49
• 3.4.6 Western Blot检测目的蛋白质49-50
• 3.4.7 昆虫细胞表达目的蛋白质的纯化50-51
• 3.4.8 昆虫细胞表达目的蛋白质加入病毒量的优化51
• 3.5 讨论51-52
• 3.6 小结52-54
• 结论与展望54-55
• 结论54
• 展望54-55
• 参考文献55-62
• 附录A 缩略语表及名称说明62-64
• 附录B-Ⅰ pFLAG-ATS载体质粒64-65
• 附录B-Ⅱ pFastBac~(TM)Dual载体质粒65-67
• 附录C-Ⅰ pFLAG-ATS-pp65_(362.504)-gB_(607-621)测序结果67-69
• 附录C-Ⅱ pFastBac~(TM)Dual-EGFP-pp65_(362-504)-gB_(607-621)测序结果69-71
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况71-72
• 致谢72-73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 饶美兰;郑瑛;张畅斌;林小红;;孕妇巨细胞病毒感染及其母婴垂直传播[J];中国生育健康杂志;2008年02期

2 邱红玉,胡志红,刘岚,吴东,王华林,邓菲,孙永玉;人巨细胞病毒pp65基因重组蛋白在昆虫细胞中的表达与分析[J];中华传染病杂志;2004年05期

3 王晓燕;彭慧琴;;人巨细胞病毒包膜糖蛋白gB、gH结构、分型及生物学活性[J];中国卫生检验杂志;2008年10期

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本文编号：758057