mTOR特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

发布时间：2017-08-30 07:20

  本文关键词：mTOR特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

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【摘要】：研究目的： 构建并筛选可表达mTOR基因特异性siRNA的慢病毒，并在此基础上采用巨噬细胞特异性启动子联合重组酶表达基因构建可在巨噬细胞内特异表达siRNA的慢病毒表达载体，为后续体内外研究其抗Mtb感染的效果及机制奠定基础。 研究方法： 1.根据mTOR基因的mRNA序列选择3条靶序列，根据每条靶序列按siRNA设计原则设计相应的shRNA，同时根据其中一条shRNA序列设计一条长度及碱基组成与之完全一致，但碱基顺序被随机打乱的序列作为对照shRNA序列。针对每条shRNA各设计一对单链寡聚脱氧核苷酸，经缓慢退火后形成可表达相应shRNA的双链DNA，通过限制性内切酶HpaⅠ和XhoⅠ克隆入慢病毒表达框架质粒pSicoR中，获取pSicoR-mTOR干扰质粒并命名为pSM系列载体。转化大肠杆菌DH5α后，筛选阳性克隆、提取质粒，经酶切鉴定正确后进行DNA测序。 2.将重组慢病毒表达载体（pSM系列质粒）、慢病毒包装质粒psPAX2、包膜蛋白质粒pMD2.G按照一定比例混合共转染293T细胞，收集含有慢病毒颗粒的上清液，超滤离心，浓缩病毒颗粒。将慢病毒颗粒感染293T细胞，利用逐孔稀释法在倒置荧光显微镜下检测荧光表达情况，并计算病毒的滴度。采用适当滴度的慢病毒颗粒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7，48h后，观察慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞的情况。采用实时荧光定量PCR和Western blot检测巨噬细胞内mTOR基因表达的变化。 3.利用PCR技术从质粒Cre-Amp中扩增出重组酶表达基因Cre，克隆至质粒pBudCE4.1-SP146的Hind III/Xba I位点中，获得重组质粒pBudCE4.1-SP146-Cre，酶切鉴定正确后送测序。 4.采用PCR技术分别扩增获取SP146-Cre片段、pSico的0至3808片段以及pSico的3783至7566片段，然后利用In-Fusion克隆技术将SP146-Cre克隆1国家自然科学基金资助项目（编号：30901284）至pSico中。将重组载体pSico-SP146-Cre转化大肠杆菌后选取阳性克隆菌，采用菌落PCR方法进行重组质粒鉴定，鉴定成功后送测序验证。 5.将SP146启动子调控的质粒pSico-SP146-Cre分别转染293T、RAW264.7细胞，通过SP146启动子调控Cre/LoxP系统情况下，通过绿色荧光的表达模式观察评价巨噬细胞特异性启动子的特异性以及SP146调控下的Cre/LoxP系统的功能。 研究结果： 1.酶切及测序的结果显示，mTor特异性siRNA表达序列及对照序列均正确插入到质粒pSicoR中，成功构建了mTOR基因特异性的siRNA慢病毒表达载体pSM1, pSM2, pSM3及对照siRNA表达载体pSM4。 2.利用293T细胞包装重组慢病毒表达载体pSM1/2/3/4，生产出慢病毒颗粒后进行病毒浓缩，经病毒滴度测定，四组慢病毒lenti-pSM1/2/3/4的滴度分别是6×106TU/ml、1×106TU/ml、4×106TU/ml、2.5×106TU/ml。四种重组慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞，48h后均可观察到明亮的绿色荧光，表明重组慢病毒能有效感染RAW264.7细胞。 3.实时荧光定量PCR及Western blot检测的结果相一致，均证实了lenti-pSM1组、lenti-pSM2组、lenti-pSM3组的mTOR mRNA及蛋白表达均受到抑制，其mTOR mRNA表达水平的抑制率分别是24.1%、59.3%、41.1%，蛋白表达水平与空白对照组（0.9567±0.021）及lenti-pSM4组（0.9200±0.030）相比三实验组的灰度值分别为：0.9033±0.025、0.883±0.031、0.893±0.032，其中lenti-pSM2组为最佳干扰效果组。 4.菌落PCR及测序结果证实，MФ特异性启动子序列SP146及Cre基因片段已成功插入质粒pSico中，，成功构建了慢病毒表达载体pSico-SP146-Cre。将该重组载体及转染入293T及RAW264.7细胞，观察到其在293T细胞中有很强的绿色荧光，但是在RAW264.7细胞中几乎没有绿色荧光。 结论： 1.成功构建了针对mTOR基因干扰序列的系列慢病毒表达载体pSM。 2.完成了慢病毒的包装和浓缩，成功地利用构建的重组慢病毒载体生产的慢病毒颗粒感染了RAW264.7细胞，并筛选出mTOR shRNA2为最有效的干扰序列。 3.成功构建了携带MФ特异性启动子序列SP146、重组酶Cre基因的慢病毒表达载体pSico-SP146-Cre。 4. SP146启动子具有良好的MФ特异性，可调控Cre/LoxP系统，为后续动物水平的实验研究奠定基础。
【关键词】：mTOR siRNA 慢病毒表达载体
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416;R373
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 中英文缩略词表11-13
• 第1章 引言13-17
• 第2章 mTOR 特异性 shRNA 表达慢病毒的构建及筛选17-43
• 2.1 概述17-18
• 2.2 材料与方法18-31
• 2.2.1 材料18-23
• 2.2.2 方法23-31
• 2.3 结果31-39
• 2.3.1 重组慢病毒载体 pSM1/2/3/4 的构建及其鉴定31-33
• 2.3.2 重组慢病毒包装及病毒滴度的测定33-35
• 2.3.3 重组慢病毒感染 RAW264.7 细胞的荧光表达35-37
• 2.3.4 实时荧光定量 RT-PCR 检测 RAW264.7 细胞中 mTOR 的表达37-38
• 2.3.5 Western blot 检测 RAW264.7 细胞中 mTOR 的表达38-39
• 2.4 讨论39-43
• 第3章 巨噬细胞特异性慢病毒表达载体 pSico-SP146-Cre 的构建与鉴定43-55
• 3.1 概述43
• 3.2 材料与方法43-50
• 3.2.1 材料43-45
• 3.2.2 方法45-50
• 3.3 结果50-53
• 3.3.1 质粒 pBudCE4.1-SP146-Cre 的构建及其鉴定50-51
• 3.3.2 慢病毒表达载体 pSico-SP146-Cre 的构建及其鉴定51-52
• 3.3.3 慢病毒表达载体转染后荧光的表达52-53
• 3.4 讨论53-55
• 第4章 全文小结55-57
• 4.1 概述55
• 4.2 主要的研究结论55
• 4.3 本课题创新之处55-57
• 致谢57-58
• 参考文献58-61
• 攻读学位期间的研究成果61-62
• 综述62-69
• 参考文献68-69

【参考文献】

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1 ;Lentivirual vector-mediated doxycycline-inducible iASPP gene targeted RNA interference in hepatocellular carcinoma[J];癌症;2010年09期

2 刘悦;郝玉娥;詹轶群;许望翔;杨永升;葛常辉;;人甘油激酶慢病毒干涉载体的构建和表达[J];南方医科大学学报;2012年05期

3 朱焕章,史景泉,public.cta.cq.cn;Cre/LoxP系统在转基因小鼠上的应用策略[J];生物化学与生物物理进展;2000年03期

本文编号：757959