乙酰胆碱受体的重组表达以及抗AChR抗体检测方法的建立

发布时间：2017-08-30 15:49

  本文关键词：乙酰胆碱受体的重组表达以及抗AChR抗体检测方法的建立

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【摘要】：重症肌无力（MG）是一种对神经肌接头处烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinicacetylcholine receptor，nAChR）产生免疫反应的自身免疫性疾病。抗nAChR抗体激活的补体攻击反应可以导致nAChR甚至突触后膜的破坏，从而引起神经肌肉传导功能障碍。 烟碱型乙酰胆碱受体为配体门控离子通道超家族成员之一，在神经肌肉接头中的突触后膜上介导化学信号向电信号的快速转化。这一家族蛋白包括甘氨酸受体、γ-氨基丁酸受体、谷氨酸受体及5-羟色胺受体。电鳐电器官及骨骼肌中的nAChR为较大的（Mr约290kDa）四种同源亚基组成的五聚体，电鳐及胚胎肌肉中为α12β1δγ，成人肌肉中为α12β1δε。亚基按α1-γ-α1-δ-β1的顺序形成一个圆柱形离子通道复合体。每个亚基都是一条多肽链，从N端到C端依次为：1个较大的N-末端胞外域（extracellular domain， ECD），3个跨膜域，1条较大的胞内环，第4个跨膜域和1个C-端尾位于胞外。nAChR N-末端胞外域对受体激动剂及竞争性拮抗剂都具有较高的亲和力。神经递质ACh主要作用在α1γ亚基和α1δ亚基交界处的两个不对等位点，而α-银环蛇毒素（α-Bungarotoxin，，α-BTx）与nAChR的结合位点则主要是α1亚基N-末端胞外域。并且，α1亚单位胞外域还包括了主要免疫原区（main immunogenicregion， MIR），是刺激重症肌无力患者形成nAChR抗体的主要位点。外源注射nAChR能使动物产生nAChR抗体，并表现出重症肌无力症状，即免疫重症肌无力主动免疫动物模型。将来还有可能将nAChR用于结合重症肌无力患者血清内的致病抗体，从而达到去除致病抗体，缓解临床症状。 有研究称，利用放射免疫法（RIA）检测MG患者血清抗-AChR抗体含量，以此作为诊断标准，其诊断敏感性为88%，且不同MG分型的阳性率也有所区别：早发眼肌型MG为71%，晚发眼肌型为88%，早发全身型为89%，晚发全身型为98%。而抗-AChR抗体阳性诊断MG的特异性高达99.9%。但是，目前国内没有将检测抗-AChR抗体作为常规诊断方法，通过我们的研究，我们成功建立了稳定的抗-AChR抗体放射免疫检测法，并希望该方法能与临床诊断相结合，提高MG诊断效率。 实验性自身免疫性重症肌无力（Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）是发生在大鼠身上的，T细胞依赖的抗体介导的自身免疫性疾病，且整个免疫过程是单纯针对nAChR的免疫反应。作为研究重症肌无力的重要研究手段，EAMG模型的构建依然是我们研究该领域的重要基础。目前构建EAMG模型的原材料主要有两种：一种是电鳐电器官，一种是哺乳动物的去神经支配肌肉。目前在国内，电鳐价格昂贵且难以获取，而大鼠去神经支配术复杂且获取量少，所以我们考虑用重组表达nAChR的方法获得稳定且具有生物学活性的蛋白。本实验共尝试了两种方法表达nAChR：①C HO细胞表达人乙酰胆碱受体α亚单位胞外域。以nAChR α1基因全长为模板，PCR法扩增nAChR α1亚基ECD1-216，酶切后装入pcDNA3.1表达载体中，脂质体转染入CHO细胞，分别在转染后6~72h的7个时间点进行荧光实时定量PCR鉴定ECD基因的表达水平，利用125I标记的银环蛇毒素测定细胞培养上清中ECD蛋白的表达。②大肠杆菌表达含三个突变碱基的大鼠乙酰胆碱受体α亚单位胞外域。将大鼠AChRα1亚基胞外域蛋白中三个氨基酸进行突变，分别为Val8Glu，Trp149Arg，Val155Ala，送公司合成上述基因。将合成基因插入pET-22b载体中，然后在Bl-21菌株中大量表达。鉴定表达正确的蛋白用溶液稀释法进行蛋白复性。 综上所述，本实验尝试可通过真核或原核细胞表达重组nAChR的方法来替代来源短缺的天然nAChR，同时建立快捷、简便的抗nAChR抗体检测方法，提高临床MG的诊断效率。
【关键词】：重症肌无力 乙酰胆碱受体 EAMG 抗-AChR抗体 放射免疫法 基因表达
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R746.1;R392
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-27
• 第一部分 AChR 的提取27-33
• 1 材料27-28
• 1.1 主要试剂27
• 1.2 主要试剂的配制27-28
• 1.3 实验材料准备28
• 1.4 主要仪器28
• 2 方法28-30
• 2.1 大鼠的去神经支配术28-29
• 2.2 大鼠 AChR 的粗提29
• 2.3 人 AChR 的粗提29-30
• 2.4 BCA 法检测大鼠及人 AChR 粗提物的浓度30
• 3 结果30-32
• 3.1 去神经支配术后大鼠的临床表现30-31
• 3.2 乙酰胆碱受体的浓度31-32
• 4 讨论32-33
• 第二部 抗 AChR 抗体检测方法的建立33-39
• 1 材料33-34
• 1.1 主要试剂33
• 1.2 主要试剂的配制33
• 1.3 实验材料准备33-34
• 2 方法34-36
• 2.1 兔抗人 IgG 抗体的制备34-35
• 2.2 放射免疫法检测抗 AChR 抗体方法的建立35
• 2.3 放射免疫法检测患者血清中 AChR 抗体35-36
• 3 结果36-38
• 3.1 免疫双扩实验结果36
• 3.2 放射免疫实验方法的建立36-37
• 3.3 放射免疫法检测患者血清中 AChR 抗体37-38
• 4 讨论38-39
• 第三部分 真核重组表达人 nAChRα1 亚单位胞外域39-50
• 1 材料39-41
• 1.1 载体质粒、菌株及细胞39
• 1.2 主要试剂39
• 1.3 主要试剂的配制39-40
• 1.4 主要仪器40-41
• 2 方法41-46
• 2.1 人 AChR α1 亚单位胞外域基因的合成41-42
• 2.2 pcDNA3.1-ECD 载体构建42-44
• 2.3 CHO-k1 细胞的转染44-45
• 2.4 荧光实时定量 PCR 法检测目的基因的表达45
• 2.5 放射免疫沉淀法检测蛋白的表达45-46
• 3 结果46-48
• 3.1 真核表达载体 pcDNA3.1-ECD 的鉴定46
• 3.2 转染细胞的 RNA 逆转录结果46-47
• 3.3 荧光实时定量 PCR 结果47-48
• 3.4 放射免疫法检测 ECD 蛋白表达量及蛋白的生物学活性48
• 4 讨论48-50
• 第四部分 原核重组表达三个碱基突变的 nAChRα1 胞外域蛋白50-63
• 1 材料50-53
• 1.1 载体质粒及菌株50
• 1.2 主要试剂50-51
• 1.3 主要试剂的配制51-53
• 1.4 主要仪器53
• 2 方法53-59
• 2.1 pET22b-mα1tmECD 载体的构建53-56
• 2.2 pET22b-mα1tmECD 的原核表达56-57
• 2.3 pET22b-mα1tmECD 蛋白的纯化与复性57-59
• 3 结果59-61
• 3.1 pET22b-mα1tmECD 重组质粒鉴定59-60
• 3.2 SDS-PAGE 鉴定 mα1tmECD 蛋白的表达60
• 3.3 蛋白复性条件的优化60-61
• 4 讨论61-63
• 小结63-64
• 参考文献64-71
• 个人简历和研究成果71-72
• 致谢72-73

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 刘伟,刘国津,范志民,盖学良;Myasthenia gravis in pediatric and elderly patients[J];Chinese Medical Journal;2003年10期

本文编号：760213