铜绿假单胞菌PAO1 lasI、rhlI基因缺失菌株的构建及其对接合的影响

发布时间：2017-08-31 00:11

  本文关键词：铜绿假单胞菌PAO1 lasI、rhlI基因缺失菌株的构建及其对接合的影响

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【摘要】：目的： 细菌与细菌之间存在交流,许多种类的细菌可以根据特定信号分子的浓度来监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化,当环境中信号分子达到一定浓度阈值时,信号分子进入细胞内与胞内受体结合启动相关基因的表达来适应环境的变化,这一调节体系即为细菌群体感应系统(Quorum Sensing System, QS)或密度感应系统,也称自诱导(autoincer, AIs)[1]。 在铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)中,至少存在两套基于AHLs(Acyl-homoserine lactone,或HSL,即高丝氨酸内酯)调节的QS系统：一种是控制细胞外毒力因子表达的1as系统,另一种是控制几种二级代谢所需产物的rhl系统。las系统由LasR和Lasl组成,rhl系统则由RhlR和RhlI组成。LasR和RhlR为信号分子受体,而LasI和RhlI则分别是HSL信号分子N-3-oxododecanoyl-L-homoserinelactone(3-oxo-C12-HSL或OdDHL)和N-butanoyl-L-homoserinelaetone(C4-HSL,或BHL)的合成酶,分别由lasI和rhlI基因编码合成。QS系统中,存在着一定的级联关系,有研究表明las系统在这种级联关系中处于最高层,可以激活另外一些调节器的转录表达,如RhlR/RhlI;在QS这个调控的关系网中,Las系统的作用是最主要的,它能调控Rhl,使3-oxo-C12-HSL的分泌不受C4-HSL的影响。 PA是一种临床常见的革兰阴性条件致病菌,随着抗生素的广泛应用和不合理使用,使得PA对抗生素的耐药程度日趋严重,泛耐、全耐的PA层出不穷,给临床PA感染的治疗带来了极大的困难,PA的耐药主要由两种机制引起：一是染色体上结构基因发生点突变、插入或缺失,引起编码的蛋白质氨基酸序列发生改变,导致对抗菌药物的敏感性降低或丧失,如外膜孔蛋白OprD2缺失、青霉素结合蛋白靶位改变等；二是通过细菌间耐药基因水平转移(horizontal gene transfer, HGT)获得耐药基因。耐药基因水平转移方式有转导、转化和接合,而接合(conjugation)是耐药基因水平转移的一个主要方式,调节接合转移的机制很多,但目前尚不十分清楚。有研究表明,酰基高丝氨酸内酯(acylated homoserine lactones, HSL)在根癌土壤杆菌Ti质粒的接合转移中起重要作用,但在PA耐药基因水平转移中是否发挥作用尚未见报道。 为给研究HSL在铜绿假单胞菌中接合反应中的作用奠定更好的基础,本实验分别对PA01菌株lasI、rhlI基因进行单、双突变,构建突变菌株,并在此基础上研究HSL对接合反应频率的影响。 方法： 1.构建PA01lasI、rhlI基因分别单、双缺失突变的菌株采用同源重组的方式,首先通过PCR扩增lasI、rhlI的上下游片段,分别插入pMDl8、pUCl9,然后在此基础上插入正向筛选标记庆大霉素耐药基因(GM)、反向筛选标记蔗糖敏感基因(sacB)以及接合转移基因(mob),构建带有同源片段的自杀性质粒pGSM-△lasI和pGSM-△rhlI。通过接合转移的方式将质粒pGSM-△lasI转入PA01可获得lasI单突变菌株,将质粒pGSM-△rhlI转入PA01可获得rhlI单突变菌株,再将pGSM-△lasI转入rhlI单突变菌株中则可获得双突变菌株。 2.突变菌株的鉴定首先,设计lasI、rhlI基因的外引物,通过PCR对同源重组的菌株初筛并测序确定；其次,合成生物素标记的探针,采用southern blot对lasI基因单突变的菌株实行进一步确证；再次,建立高效液相色谱串联质谱(HPLC/MS)检测HSL的方法,从基因表达方面来验证lasI、rhlI基因缺失后HSL信号分子分泌情况。 3.建立E.coli-PA接合反应模型,研究HSL对接合反应频率的影响采用滤膜杂交法,E.coliSM10λ pir(pUCP24T)分别与PA01,PA-△lasI、 PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI进行接合反应,通过平板菌落计数法计算接合反应频率。 结果： 1.构建自杀性质粒pGSM-△lasI,pGSM-△rhlI,lasI基因缺失菌株PA-△lasI,rhlI基因缺失菌株PA-△rhlI,以及lasI、rhlI双缺失菌株PA-△lasIrhlI。并通过PCR及基因测序、Southern blot证实突变菌株构建成功。 2.通过HPLC/MS检测HSL,PA-△lasI菌株中未检测到3-oxo-C12-HSL且C4-HSL也低于检测限；PA-△rhlI菌株中检测到3-oxo-C12-HSL正常产生且与PA01比较无差异(P0.05),但C4-HSL检测不到；PA-△lasIrhlI菌株中3-oxo-C12-HSL与C4-HSL均检测不到。3-oxo-C12-HSL在与C4-HSL在6h时开始检测到,且随着时间增加,C4-HSL的量逐渐增加,而3-oxo-C12-HSL则基本保持稳定。加入2u g/mL阿奇霉素(AZM)后,3-oxo-C12-HSL与PA01组相较明显减少,差异有统计学意义(P0.05),C4-HSL量有减少趋势但与PA01比较差异无统计学意义(P0.05)。 3.在E.coli-PA接合反应中,PA-△lasI、PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI的接合反应频率较PA01组降低(P0.05)。 结论： 1.成功构建lasI、rhlI基因单、双突变菌株PA-△lasI、PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI。 2.lasI基因位于rhlI基因的上游并对其有调控作用,当lasI基因缺失突变后,菌株不仅不再合成3-oxo-C12-HSL,而且C4-HSL的量也明显减少。rhl7基因缺失后,C4-HSL合成被阻断,但3-oxo-C12-HSL的合成并未受影响。lasI、rhlI双缺失后HSL信号分子在相应基因缺失后分泌明显减少。2u g/mL AZM能抑制HSL的分泌。 3.在PA-E.coli接合反应中,本实验构建的突变菌株PA-△lasI.PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI与PA01组比较,HSL信号分子量明显减少,其接合反应频率也均降低,这可能是因为HSL在PA的接合转移中起了重要作用,但具体的机制还有待进一步研究。
【关键词】：铜绿假单胞菌 群体感应系统 同源重组 高丝氨酸内酯 自杀性质粒 接合反应
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 目录10-12
• 引言12-14
• 第一部分 载体及突变菌株构建14-27
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 菌株14-15
• 1.1.2 主要培养基及抗生素15
• 1.1.3 主要试剂15
• 1.1.4 主要仪器15
• 1.2 实验方法15-24
• 1.2.1 构建同源重组载体16-19
• 1.2.1.1 pGSM-△lasI载体(串联lasI基因上下游片段自杀性质粒的构建)16-18
• 1.2.1.2 pGSM-Arhll载体（串联r/?7/基因上下游片段自杀性质粒的构建）18-19
• 1.2.2 同源重组突变菌株的建立19-20
• 1.2.3 实验具体操作方法20-23
• 1.2.4 接合转移23-24
• 1.3 结果24-25
• 1.3.1 载体pGSM-ΔlasI,pGSM-ΔrhlI的鉴定24
• 1.3.2 同源重组构建突变菌株24-25
• 1.4 讨论25-27
• 第二部分 突变菌株的鉴定27-38
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 Southern Blot所用试剂及配制方法27
• 2.1.2 HPLC/MS所需试剂及材料27-28
• 2.1.3 HPLC/MS主要仪器28
• 2.2 方法28-31
• 2.2.1 PCR鉴定及基因测序28
• 2.2.2 Souther Blot28-29
• 2.2.3 HPLC-MS(高效液相色谱-串联质谱)检测HSL29-31
• 2.3 结果31-36
• 2.3.1 PCR及基因测序对突变菌株的鉴定31-32
• 2.3.2. Southern blot鉴定突变株PA-ΔlasI32-33
• 2.3.3 HPLC/MS检测33-36
• 2.4 讨论36-38
• 第三部分 lasI与rhlI基因缺失对接合反应频率的影响38-41
• 3.1 材料38
• 3.1.1 菌株与质粒38
• 3.1.2 试剂及仪器38
• 3.2 方法38-39
• 3.2.1 PA生长曲线38
• 3.2.2 接合反应38
• 3.2.3 统计方法38-39
• 3.3 结果39-40
• 3.3.1 PA01野生株及其lasI、rhlI基因单双缺失菌株的生长曲线39
• 3.3.2 lasI与rhlI基因缺失对接合反应频率的影响39-40
• 3.4 讨论40-41
• 结语41-42
• 参考文献42-45
• 综述45-52
• 参考文献49-52
• 附录52-54
• 在校期间发表论文情况54-55
• 致谢55

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 陈茶;林冬玲;李有强;张妮;袁慧;曾建明;张伟铮;黄彬;;多重耐药铜绿假单胞菌分子流行病学的研究[J];国际检验医学杂志;2011年21期

2 綦国红;董明盛;王岁楼;;N-酰基-高丝氨酸内酯类群体感应信号分子检测方法的建立[J];农业生物技术学报;2007年04期

3 徐操;李曼;黄媛媛;张哲;边子睿;宋水山;;细菌群体感应参与铜绿假单胞菌胞内聚羟基脂肪酸酯合成的调控[J];微生物学报;2011年06期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 沈继录;耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌耐药机制研究[D];复旦大学;2008年

2 陈一强;绿原酸对铜绿假单胞菌生物膜抑制作用及其机制的体内外研究[D];广西医科大学;2010年

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本文编号：762301