HO-1增强大鼠骨髓间充质干细胞活性及其免疫调节作用

发布时间：2017-08-31 02:19

  本文关键词：HO-1增强大鼠骨髓间充质干细胞活性及其免疫调节作用

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【摘要】：目的：(1)探讨血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1, HO-1)对大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BM MSCs)自身活性的影响。(2)探讨HO-1基因修饰的BM MSCs (HO-1/MSCs)在体外对淋巴细胞的影响及其机制。 方法：(1)选用4-5周龄清洁级雄性Wistar大鼠,处死消毒后取其长骨,用含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的DMEM/F12培养液冲洗骨髓腔,收集冲洗液,采用密度梯度离心联合贴壁筛选法分离培养并扩增BM MSCs。倒置显微镜下观察BM MSCs细胞形态,荧光标记抗体与细胞孵育后,流式细胞术鉴定第3代细胞的表型,并检测其诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的能力。(2)用载有HO-1基因的重组腺病毒载体感染BM MSCs,形成HO-1/BM MSCs,在荧光显微镜下观察其转染率。提取细胞总RNA和总蛋白,分别应用实时荧光定量RT-PCR法和Western印迹法分析细胞内HO-1mRNA和蛋白的表达水平并计算HO-1的表达差异。(3)将第3代BM MSCs和HO-1/BM MSCs接种在E-Plate电极板中,用含10%FBS的培养液培养至贴壁后,更换为低血清(2%FBS)的DMEM/F12培养液,并用二氯化钴(CoCl2)处理细胞12小时,建立缺血缺氧的环境。采用实时细胞分析仪分析细胞生长速度,绘制生长曲线,并用Annexin V/PI染色和流式细胞术检测细胞凋亡情况。(4)混合淋巴细胞培养：将HO-1/BM MSCs及对照组GFP/BM MSCs与大鼠脾淋巴细胞、刀豆蛋白(Concanavalin, ConA)建立共培养体系,混合培养0h、24h和48h后,用MTT法检测淋巴细胞的增殖活性,碘化丙啶染色流式细胞术分析细胞周期的分布情况,ELISA法检测细胞因子含量,流式细胞术分析T淋巴细胞亚群及其活化标志CD25、CD71的表达。 结果：(1)体外成功培养和扩增出大鼠BM MSCs。细胞贴壁生长,传代后的细胞呈长梭形,部分呈漩涡或菊花状排列,具备典型的MSCs形态特征。细胞表面标记检测显示,CD29、CD90和RT1A均为阳性,阳性率分别为99.49%、90.12%和98.99%；而CD34、CD45和RT1B均为阴性,阴性率均95%。细胞能够诱导分化成为脂肪细胞(油红O染色示胞浆内出现红色脂滴)和成骨细胞(von Kossa染色示细胞中出现黑色钙盐)。(2)用表达HO-1基因的重组腺病毒感染BM MSCs48h后,荧光显微镜下观察发现细胞中绿色荧光表达阳性率80%。实时荧光定量RT-PCR检测发现,HO-1基因表达明显上调,表达量约为对照细胞的5倍。Western印迹结果显示,与对照组相比,HO-1/BM MSCs中HO-1蛋白的表达量明显提高。(3)生长曲线显示,在正常培养条件下,载有HO-1基因的腺病毒感染对BM MSCs增殖没有明显的影响。但在缺血缺氧条件下,HO-1/MSCs的增殖活性明显强于对照组。流式细胞术检测结果显示,在正常培养条件下,HO-1/BM MSCs组和对照组细胞凋亡率均很低,但在缺血缺氧条件下,HO-1/BM MSCs组凋亡细胞百分数明显低于对照组。(4) HO-1/BM MSCs参与共培养的T淋巴细胞的增殖活性和细胞周期进程均被抑制,促炎因子(IL-2、TNF-α和IFN-y)的分泌量降低、抗炎因子(IL-10)的分泌量升高,T淋巴细胞亚群分化比例降低,同时T淋巴细胞活化标志CD25和CD71的表达降低,与BM MSCs组相比有统计学意义。 结论：(1) BM MSCs是一类具有多向分化潜能的干细胞,采用密度梯度离心联合贴壁法可分离、纯化大鼠BM MSCs,方法简单,费用低廉,可以作为培养大鼠BM MSCs的常规方法。(2)用载有HO-1基因的重组腺病毒感染大鼠BM MSCs后,HO-1蛋白的表达明显增强。(3)在缺血缺氧条件下,HO-1能够促进BM MSCs增殖并抑制其凋亡。(4)与亲代BM MSCs相比,HO-1/BM MSCs能够更好地发挥对淋巴细胞的免疫调节作用。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 血红素加氧酶-1 细胞活性 淋巴细胞 免疫调节
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• ~.略语/符号说明11-12
• 前言12-16
• 研究现状、成果12-14
• 研究目的、方法14-16
• 一、BMMSCs的体外分离、培养和鉴定16-24
• 1.1 材料和方法16-18
• 1.1.1 实验材料16-17
• 1.1.2 实验方法17-18
• 1.2 结果18-22
• 1.2.1 BMMSCs的分离纯化、培养扩增18
• 1.2.2 BM MSCs表型鉴定18-21
• 1.2.3 BM MSCs诱导分化能力鉴定21-22
• 1.3 讨论22-23
• 1.4 小结23-24
• 二、HO-1对大鼠BM MSCs自身活性的影响24-31
• 2.1 材料和方法24-25
• 2.1.1 实验材料24
• 2.1.2 实验方法24-25
• 2.1.3 统计分析25
• 2.2 结果25-29
• 2.2.1 重组腺病毒载体成功介导HO-1在BM MSCs中的表达25-27
• 2.2.2 HO-1对BM MSCs增殖的影响27
• 2.2.3 HO-1对BM MSCs凋亡的影响27-29
• 2.3 讨论29-30
• 2.4 小结30-31
• 三、HO-1修饰的BM MSCs在体外对淋巴细胞的影响31-39
• 3.1 材料和方法31-32
• 3.1.1 实验材料31
• 3.1.2 实验方法31-32
• 3.1.3 统计学方法32
• 3.2 结果32-37
• 3.2.1 HO-1/BM MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用33-35
• 3.2.2 HO-1/BM MSCs对淋巴细胞分泌细胞因子的影响35
• 3.2.3 HO-1/MSCs对T淋巴细胞亚群分化及表面活化标志表达的影响35-37
• 3.3 讨论37-38
• 3.4 小结38-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• 发表论文和参加科研情况说明44-45
• 附录45-49
• 综述 小肠移植与肠道微生态变化49-56
• 综述参考文献53-56
• 致谢56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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本文编号：762876