肠道病毒71型不同毒力表型分离株感染ICR鼠的研究

发布时间：2017-09-01 04:44

本文关键词：肠道病毒71型不同毒力表型分离株感染ICR鼠的研究

【摘要】：肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornavirdae),肠道病毒属(Enterovirus, EV)。EV71是导致手足口病(HFMD)最为常见的病原体之一,通常引起患者手、足、口腔等部位皮肤粘膜的皮疹、疱疹,可自愈。个别可累及中枢神经系统,主要表现为无菌性脑膜炎、脑干脑炎、脊髓灰质炎样麻痹等,以婴幼儿和5岁以下儿童感染为主,致残及病死率较高。近年来EV71病毒感染在亚太国家和地区的流行呈上升趋势。然而,目前仍没有特效的药物或疫苗用于EV71感染的防治,EV71的致病机制也不明了。动物模型是进行病毒致病机制、感染特点的研究和病毒疫苗及药物疗效评价的重要手段,但目前尚未找到可用于EV71研究的动物模型。本研究针对目前我国EV71动物模型方面研究的匮乏与病毒分子机制研究的需要,运用分离自山东临沂手足口病患儿的EV71分离株SDLY107与SDLY11株进行实验,以期建立一个不同毒力表型分离株的EV71动物感染模型,旨在探讨EV71不同毒力表型分离株引起不同临床表现的原因。本次研究采用EV71山东分离株SDLY107(死亡患儿分离株)、SDLY11(仅表现皮疹和发热的轻症患儿分离株)分别对1日龄,2周龄ICR乳鼠经腹腔注射感染,同时对感染小鼠进行了临床表现、病原学、病毒分子生物学和病理学等方面的研究,从而建立起EV71不同毒力表型分离株小鼠感染模型,对今后开展EV71毒力相关致病机制的研究具有重要意义。目的 1.比较EV71轻重症分离株感染不同日龄ICR小鼠后的感染特点,为进一步研究EV71感染后引起不同症状的原因提供依据。 2.用本实验室建立的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR测定EV71RNA病毒拷贝数的方法,检测EV71轻、重症分离株分别感染1日龄和2周龄小鼠后肌肉组织EV71RNA拷贝数,评价轻、重症分离株在小鼠体内复制情况的差异。 3. ELISA试验法逐日测定1日龄和2周龄小鼠血清中EV71抗体滴度,评价轻、重症分离株病毒分别感染后宿主的抗体生成情况,从而判断病毒在宿主体内的中和情况,为进一步研究SDLY107与SDLY11感染小鼠后产生不同毒力的原因提供依据。方法 1.采用EV71山东分离株SDLY107(死亡患儿分离株)、SDLY11(仅表现皮疹和发热的轻症患儿分离株)分别对1日龄,2周龄ICR乳鼠经腹腔注射感染(CCID50均为10-4)。 2.将动物按日龄及处理方式分组,分别为1日龄SDLY107株实验A组、1日龄SDLY107株实验B组、1日龄SDLY11株实验C组、1日龄SDLY11株实验D组、1日龄对照组E组、2周龄SDLY107株实验F组、2周龄SDLY107株实验G组、2周龄SDLY11株实验H组、2周龄SDLY11株实验I组2周龄对照组J组,每组5-10只,通过腹腔注射途径感染,其中对照组用生理盐水感染。 3.病毒接种后观察小鼠临床表现并于3d、4d、5d、6d、7d采集1日龄SDLY107株实验A组、1日龄SDLY11株实验C组、2周龄SDLY107株实验F组、2周龄SDLY11株实验H组肺、脑、肠、肌肉组织。 4.将1日龄SDLY107株实验B组、1日龄SDLY11株实验D组、2周龄SDLY107株实验G组、2周龄SDLY11株实验I组、1日龄对照组E组及2周龄对照组F组小鼠连续两周每天取一只摘眼球取血,用间接ELISA试验法检测小鼠血清抗体滴度,并取其肌肉组织进行病毒拷贝数的测定。 5.建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR测定EV71病毒载量的方法。使用含有目的序列RNA标准品制备标准曲线,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估,并对小鼠体内各组织中的病毒拷贝数进行准确定量。结果 1.ICR1日龄乳鼠和2周龄乳鼠分别经腹腔注射感染SDLY107、SDLY11分离株后,SDLY107分离株感染的乳鼠表现出明显的症状,包括竖毛、弓背、消瘦、肢体麻痹,SDLY11分离株感染的乳鼠症状明显较轻,对照组(生理盐水)乳鼠无明显变化。各组织病理检查发现,SDLY107与SDLY11感染的乳鼠各脏器均表现出病理变化,SDLY107病理变化更明显,对照组未观察到病理变化。 2.建立了SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法。该方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA的定量测定。实时荧光定量RT-PCR检测结果表明,SDLY107在各组织中的病毒载量均高于SDLY11,肌肉组织中病毒载量最高。感染SDLY107的1日龄乳鼠肌肉组织病毒拷贝数于5d达到最高值,为6.02×104copies/μl。感染SDLY11的1日龄乳鼠肌肉组织病毒拷贝数于7d达到最高值,为3.27×104copies/μl。 3. ELISA结果显示,随着感染天数的增加,小鼠血清抗体的A值检出增加,其中1日龄小鼠的血清抗体A值最高出现在7d,2周龄小鼠的血清抗体A值最高出现在8d。2周龄小鼠的血清产生抗体水平明显高于1日龄小鼠。相同日龄小鼠感染SDLY107和SDLY11,血清抗体A值具有相同的趋势。结论 1.不同毒力表型的分离株在ICR乳鼠感染中表现出不同致病能力。 2.不同毒力表型的分离株在ICR乳鼠体内表现出不同的复制能力。这种复制能力的不同可能与感染后引起不同临床表型有关,而复制能力的改变可能取决于病毒自身与复制有关的区域关键氨基酸突变,也与宿主自身产生抗体对病毒的消除作用有关。 3.本研究建立的SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法。该方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA的定量测定,为评价动物体内病毒载量、建立动物模型及疫苗和药物的研发打下了基础。
【关键词】：肠道病毒71型 ICR乳鼠 毒力 实时定量RT-PCR
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373
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