人赖氨酸特异性去甲基化酶LSD1小分子抑制剂的发现

发布时间：2017-09-01 21:35

  本文关键词：人赖氨酸特异性去甲基化酶LSD1小分子抑制剂的发现

  更多相关文章： LSD1 高通量筛选 肿瘤 抑制剂 非组蛋白底物

【摘要】：人赖氨酸特异性去甲基化酶(Human lysine specific demethylasel, LSD1)是胺氧化酶家族成员,在黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)的参与下,LSDl可以特异去除组蛋白H3上第四位(H3K4)和第九位(H3K9)赖氨酸残基上的二甲基和一甲基修饰。LSD1还能去除其它一些非组蛋白底物上的甲基化修饰,例如p53和DNMT1等。LSD1具有多种生物学功能,主要包括促进肿瘤增殖、抑制能量代谢、促进脂肪合成、抑制脂解和调控细胞分化等。2014年,EMA批准第一个LSD1特异型抑制剂ORY-1001进行一期临床试验,用于治疗急性髓系白血病。因此,LSD1成为潜在的药物作用靶标。 我们从大肠杆菌表达系统中表达并纯化得到了GST融合表达的LSD1重组蛋白,利用Perkin Elmer公司的Lance试剂盒成功建立并优化了LSDl活性检测方法,建立了LSD1的高通量筛选(High throughput screening, HTS)模型。并对国家化合物样品库和国家新药筛选中心化合物库中的337563个样品进行筛选,得到284个抑制活性较好的化合物。其中37个样品ICso低于0.5μg/mL,抑制活性最好的化合物为WNN0649-F005,其抑制LSD1的IC50为0.012μg/mL,与进入临床一期的化合物ORY-1001抑制IC50相当。 我们进一步利用MTS方法检测了部分化合物对THP-1、HL-60和RPMI8226三株肿瘤细胞株增殖抑制的情况和对胺氧化酶MAOA的选择性抑制活性,最终发现化合物WNN0649-F005和WNN0819-F004对这三株细胞具有较好的增殖抑制活性,同时部分LSD1化合物同样具有对MAOA抑制活性。 综上所述,我们通过建立LSD1的高通量筛选模型,筛选获得一批对LSD1活性抑制较好的化合物,并通过MTS方法验证了化合物抑制肿瘤细胞增殖的效果。为进一步的化合物结构改造和抗肿瘤的药物发现打下了基础,具有重要的研究价值和应用前景。
【关键词】：LSD1 高通量筛选 肿瘤 抑制剂 非组蛋白底物
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3411
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 绪论11-27
• 1.1 表观遗传学11-13
• 1.2 组蛋白的甲基化修饰13-14
• 1.3 LSD1的结构简介及生物学功能14-27
• 1.3.1 LSD1的分子结构14-16
• 1.3.2 LSD1非组蛋白底物16-17
• 1.3.3 LSD1的组织分布17-18
• 1.3.4 LSD1的生物学功能18-23
• 1.3.5 LSDl现有抑制剂23-27
• 第二章 LSD1活性蛋白的表达及纯化27-43
• 2.1 材料27-29
• 2.2 试验方法29-35
• 2.2.1 常规分子生物学方法29
• 2.2.2 引物的设计以及合成29
• 2.2.3 目的基因的扩增29-30
• 2.2.4 限制性内切酶酶切30
• 2.2.5 连接与转化30-31
• 2.2.6 质粒抽提与验证31
• 2.2.7 重组蛋白表达条件的摸索31-32
• 2.2.8 重组目的蛋白的纯化32-33
• 2.2.9 蛋白浓度测定33
• 2.2.10 目的蛋白活性的检测33-34
• 2.2.11 最适反应酶浓度34
• 2.2.12 最适反应时间34-35
• 2.2.13 阳性化合物确认35
• 2.3 实验结果35-41
• 2.4 讨论41-43
• 第三章 LSD1抑制剂的高通量筛选43-57
• 3.1 材料43-44
• 3.2 方法44-50
• 3.2.1 高通量筛选反应体系的确定44-45
• 3.2.2 高通量筛选前的质量控制45-46
• 3.2.3 高通量筛选46-50
• 3.3 结果50-55
• 3.3.1 筛选系统的稳定性和可信度50-51
• 3.3.2 高通量筛选结果51-55
• 3.4 讨论55-57
• 第四章 LSD1抑制剂细胞水平评价和选择性评价57-68
• 4.1 材料57-58
• 4.2 方法58-60
• 4.2.1 细胞培养58
• 4.2.2 MTS法检测细胞活性58-59
• 4.2.3 MAOA检测原理59
• 4.2.4 MAOA最适反应浓度的确定59-60
• 4.2.5 MAOA最适反应时间60
• 4.2.6 MAOA最适底物浓度60
• 4.2.7 阳性化合物确认60
• 4.2.8 候选化合物对MAOA活性的影响60
• 4.3 实验结果60-66
• 4.4 实验讨论66-68
• 结论68-70
• 参考文献70-76
• 硕士期间取得的科研成果76-77
• 致谢77-78

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