SELEX技术筛选钙通道特异性核酸适配体及其抗肥大细胞活化的作用

发布时间：2017-09-02 18:26

  本文关键词：SELEX技术筛选钙通道特异性核酸适配体及其抗肥大细胞活化的作用

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【摘要】：目的筛选针对Orai1分子第1膜外区蛋白的核酸适配体,探讨适配体通过拮抗钙离子释放激活通道(Ca2+release activation channel,CRAC)抑制肥大细胞活化的效应。方法构建随机单链DNA文库,利用不对称PCR对单链DNA文库进行扩增。采用聚苯乙烯酶联板为介质的指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligand by exponential enrichment,SELEX)技术筛选核酸适配体。利用酶联免疫吸附实验检测各轮筛选序列与靶蛋白的亲和力,验证适配体与靶蛋白的特异性结合;激光共聚焦显微镜观察适配体对细胞内钙离子浓度变化的影响;利用IgE介导的肥大细胞脱颗粒模型,观察适配体对β-氨基己糖苷酶释放的抑制效应。结果经过12轮SELEX筛选,获得了7条核酸适配体,其中AptamerY1解离常数(Kd值)为1.72×10-8mol/L。以终浓度2μg/mL的AptamerY1可抑制由IgE介导的人肥大细胞系LAD2钙离子内流,并对LAD2细胞的β-氨基己糖苷酶释放抑制率达95%。结论通过SELEX筛选,获得了7条针对Orai1分子第1膜外区的核酸适配体,所获得适配体可对肥大细胞LAD2钙内流有效抑制,进而抑制肥大细胞活化和β-氨基己糖苷酶的释放。
【作者单位】： 第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科;第三军医大学药学系药理学教研室;第三军医大学军事预防医学院全军复合伤研究所 创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室;
【关键词】： 肥大细胞 SELEX适体技术 钙离子释放激活通道 β-氨基己糖苷酶
【基金】：国家自然科学基金(30972647)~~
【分类号】：R346
【正文快照】： 2006年Feske等[1]识别出一种新蛋白,命名为Orai1,证实了Orai1蛋白是钙离子释放激活通道(Ca2+release activation channel,CRAC)的组成部分。20世纪90年代,SELEX技术[2]问世,由此获得的适配体可与靶分子高特异性和高亲和力地结合。适配体的另外一个优点是没有免疫原性[3],故在

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