大鼠骨髓间充质干细胞制备及其向感觉神经元样细胞转化技术研究

发布时间：2017-09-02 20:26

  本文关键词：大鼠骨髓间充质干细胞制备及其向感觉神经元样细胞转化技术研究

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【摘要】：目的： 对大鼠BMSCs的体外分离、培养、扩增、鉴定及其向感觉神经元诱导条件进行优化,建立本实验室快速稳定获取大鼠BMSCs及其转化为感觉神经元样细胞技术流程,为BMSCs内耳移植治疗感音神经性耳聋提供理论基础和技术规范。 方法： 1、体外利用密度梯度离心法采集分离培养纯化大鼠BMSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD44、CD90、CD106、CD34、CD45表达情况，成骨及成脂诱导液诱导所获得细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化,以茜素红及油红O染色法鉴定成骨分化中钙结节及脂肪分化中脂滴的形成。 2、用两步法诱导大鼠BMSCs为感觉神经元样细胞：第一步用添加EGF和IGF-1诱导液诱导BMSCs为内耳神经前体细胞,细胞免疫荧光验证其表面蛋白SOX2和PAX8表达情况,第二步分别用BMP4诱导组和无BMP4诱导组继续向感觉神经元样细胞诱导,通过realtime-PCR比较各组间细胞内NeuroD、Neurog1、GluR4、NF-M基因mRNA水平,选取最优诱导方案。最后通过细胞形态学观察、细胞免疫荧光检测细胞表面蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin、 β-Ⅲ tubulin、Tau表达情况,对最优方案诱导后的细胞进行鉴定。 结果： 1、通过规范化细胞制备技术获取大量形态均一贴壁生长细胞。流式细胞仪结果显示：细胞表面抗原CD44、CD90、CD106分别表达为99.9%、77.3%、99.5%；造血细胞来源的表面抗原CD34和CD45分别表达为3.22%和4%。成脂诱导后油红O染色可见脂滴,成骨诱导后茜素红染色可见橙红钙结节,证实我们获取大量高纯度的BMSCs。 2、Realtime-PCR结果显示BMP、SHH和RA联合诱导能显著提升大鼠BMSCs内NeuroD、Neurog1、GluR4、NF-M基因mRNA水平。诱导后细胞具有神经元特殊形态,处于生长平台期,感觉神经元相关蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin、β-Ⅲ tubulin、Tau阳性,证实我们成功的将BMSCs诱导为感觉神经元样细胞。 结论： 1、本实验成功建立和优化了BMSCs制备技术,规范了细胞采集、分离、培养及鉴定的流程,为获取高质量BMSCs提供了理论和实践参考。 2、本实验成功建立了BMSCs诱导为感觉神经元样细胞转化技术；通过realtime-PCR技术、细胞形态学观察、细胞免疫荧光技术证明BMP4、SHH和RA联合诱导可获得高质量感觉神经元样细胞。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 细胞培养 BMP4 诱导分化 感觉神经元细胞
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 英文~.略词11-12
• 前言12-14
• 第一章 大鼠骨髓间充质干细胞制备技术14-24
• 1.1 引言14
• 1.2 实验材料与试剂14-16
• 1.2.1 材料14
• 1.2.2 主要实验仪器及耗材14-15
• 1.2.3 主要试剂和药品15-16
• 1.2.4 主要试剂的配制与保存16
• 1.3 实验方法16-20
• 1.3.1 大鼠BMSCs分离及培养16-18
• 1.3.2 BMSCs传代18
• 1.3.3 BMSCs冻存及复苏18-19
• 1.3.4 流式细胞仪检测19
• 1.3.5 体外诱导BMSCs向成骨分化及茜素红染色19
• 1.3.6 体外诱导BMSCs成脂分化及油红O染色19-20
• 1.4 结果与分析20-22
• 1.4.1 细胞形态学变化20-21
• 1.4.2 流式细胞仪检测21-22
• 1.4.3 体外诱导BMSCs向成骨成脂分化22
• 1.5 讨论22-23
• 1.5.1 大鼠BMSCs的采集分离培养纯化22
• 1.5.2 BMSCs的鉴定22-23
• 1.6 小结23-24
• 第二章 大鼠骨髓间充质干细胞向感觉神经元样细胞转化技术及鉴定24-40
• 2.1 引言24-25
• 2.2 实验材料与试剂25-27
• 2.2.1 主要实验仪器及耗材25-26
• 2.2.2 主要试剂和药品26-27
• 2.2.4 主要试剂的配制与保存27
• 2.3 实验方法27-31
• 2.3.1 BMSCs向感觉神经元样细胞诱导过程27-28
• 2.3.2 细胞免疫荧光28-29
• 2.3.3 总RNA的提取29
• 2.3.4 cDNA合成29-30
• 2.3.5 实时定量PCR30-31
• 2.3.6 细胞生长曲线31
• 2.3.7 图像获取及统计学方法31
• 2.4 实验结果31-37
• 2.4.1 向OPs细胞诱导31-33
• 2.4.2 BMP4显著提升BMSCs的感觉神经元相关蛋白的表达33-34
• 2.4.3 细胞形态学34-36
• 2.4.4 细胞生长曲线36
• 2.4.5 细胞免疫荧光36-37
• 2.5 讨论与分析37-39
• 2.5.1 大鼠BMSCs向感觉神经元样细胞转化37-38
• 2.5.2 诱导后细胞的鉴定38-39
• 2.6 小结39-40
• 全文结论40-41
• 参考文献41-45
• 综述45-53
• 参考文献50-53
• 致谢53

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