孕马尿雌酮硫酸钠单抗研制及其检测试纸条制备方法研究

发布时间：2017-09-03 13:25

  本文关键词：孕马尿雌酮硫酸钠单抗研制及其检测试纸条制备方法研究

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【摘要】：目的：研制雌酮硫酸钠单克隆抗体，研究建立检测孕马尿中雌酮硫酸钠的简单，快速，方便的胶体金免疫层析试纸条的方法，为马产业后续的工作提供所收集的每一批尿液中结合雌激素的初步检测含量。方法：1.选择12只6~8周龄的BALB/c雌性小鼠进行免疫，研究了免疫方式、免疫剂量及免疫次数对免疫效价的影响。2.选择6只BALB/c雌性小鼠，以200/100μg/只，免疫四次。用ELISA法筛选血清效价高，高抗体敏感性的小鼠。3.在50%聚乙二醇1450(PEG)的作用下，将高效价小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合(脾细胞：骨髓瘤细胞=10:1)并接种于24h前准备的饲养层细胞培养板中，HAT培养液对融合细胞进行选择性培养，用ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选、鉴定。4.采用辛酸-饱和硫酸铵法粗纯化腹水结合蛋白A亲和层析法纯化腹水，，测定腹水抗体。5.采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。用所制胶体金溶液标记抗ESS单克隆抗体，建立胶体金免疫层析快速检测孕马尿中ESS的方法，并通过检测孕马尿中雌酮硫酸钠来确证它的特异性和灵敏度。结果：1.融合率达90.2%，ELISA筛选阳性率为4.4%，并筛得两株特异性和敏感性均较好的细胞株2C8和8A7扩大培养后制备腹水单抗。纯化后的腹水单抗2C8和8A7蛋白浓度分别为3.12mg/mL，3.57mg/mL。经ELISA法检测得2C8，8A7的腹水效价分别为1:1.02×10~5，1:2.05×10~5。竞争ELISA检测2C8和8A7两株腹水单抗的IC50值为12.5ng/mL。8A7单抗与ESS结构相似的雌激素进行交叉反应性检测，与马烯雌酮硫酸钠有一定的交叉反应，与其他雌激素无交叉反应。2.所制备胶体金溶液的胶体金粒径大小紫外扫描后计算判定是19.76nm；最适抗体标记量为8μg/mL，最佳标记pH为8.2。质控线羊抗小鼠IgG包被浓度为2mg/mL，每条1.5μL；检测线ESS-Mab的包被浓度为0.5mg/mL，每条1.5μL；检测ESS标准品灵敏度为50ng/mL；特异性比多克隆抗体胶体金试纸条提高。结论：本课题首先建立了动物免疫方法，并研制出抗雌酮硫酸钠单克隆抗体，初步建立了检测孕马尿中雌酮硫酸钠的简单快速，方便的胶体金ESS单克隆抗体免疫层析试纸条的方法。
【关键词】：雌酮硫酸钠 单克隆抗体 胶体金免疫层析法 酶联免疫吸附法
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392
【目录】：

• 英文缩略词对照表5-8
• 摘要8-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-14
• 研究内容14-55
• 1. 雌酮硫酸钠单克隆抗体的制备14-46
• 1.1 试剂、材料及仪器14-18
• 1.2 试验方法18-34
• 1.3 结果34-44
• 1.4 讨论44-46
• 2. 雌酮硫酸钠单抗时纸条研制46-55
• 2.1 试剂、材料及仪器46
• 2.2 试验方法46-50
• 2.3 结果50-53
• 2.4 讨论53-55
• 小结55-56
• 致谢56-57
• 参考文献57-62
• 综述62-69
• 参考文献66-69
• 攻读硕士期间发表的学位论文69-70
• 导师评阅表70

【参考文献】

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1 王永成,常文保,郭振泉;雌三醇单克隆抗体的制备与表征[J];北京大学学报(自然科学版);2002年04期

2 王鹏;石丽媛;郭英;杜春红;尹家祥;黄鹏;钟佑宏;董珊珊;吴明寿;于国林;;检测鼠疫抗体胶体金免疫层析试纸条的研制[J];地方病通报;2006年02期

3 富青,李川江;胶体金免疫层析半定量检测方法的研究[J];湖北预防医学杂志;2002年05期

4 刘先利,刘彬,吴峰,邓南圣;环境雌激素及其降解途径[J];环境科学与技术;2003年04期

5 周昕;王江涛;赵志超;;GC法测定青岛某水体中雌激素含量[J];分析测试技术与仪器;2006年02期

6 金声,周浣芳,常文保,慈云祥,郭振泉;酶联免疫吸附法直接测定血清雌二醇[J];分析化学;1994年02期

7 常文保,张柏林,慈云祥;药物免疫分析及其进展[J];分析化学;1994年11期

8 刘风华，刘锋，邓延倬，曾云鹗，卓仁禧;现代免疫分析技术研究进展[J];分析科学学报;1995年01期

9 杨杏芬;环境雌激素污染与毒效应研究的现状与展望[J];广东卫生防疫;2001年01期

10 金士威;徐盈;惠阳;廖涛;;污水中8种雌激素化合物的定量测定[J];中国给水排水;2005年12期

本文编号：785263