p38-2G4蛋白在小鼠红系分化过程的功能初步研究

发布时间：2017-09-03 14:26

  本文关键词：p38-2G4蛋白在小鼠红系分化过程的功能初步研究

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【摘要】：红系细胞分化是一个持续的多阶段过程。正常情况下,哺乳动物成熟红细胞是由骨髓造血干细胞依次经历定向红系祖细胞、原幼红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞、晚幼红细胞和网织红细胞等多个不同的阶段发育分化产生,其终末分化的主要特征是晚幼红细胞停止分裂并表达血红蛋白,出现核固缩,核偏位和自然排核,从而形成网织红细胞,并通过血脑屏障进一步发育为成熟红细胞释放到血液中。在某些致癌因素作用下,红系造血细胞失去进一步分化为成熟红细胞的能力而停滞在细胞发育的某一阶段进而引发疾病或癌症。 深入研究红系细胞分化过程已成为国内外许多科研人员的工作重心之一。本课题组长期从事红系分化及白血病发生机制的研究,前期利用胎肝细胞,FVA细胞及二甲基亚砜诱导MEL细胞红系分化的差异蛋白质组(2-D-gel/MADIA-Tof/Tof)研究时均发现p38-2G4存在差异性表达。 p38-2G4蛋白最早作为一种DNA结合蛋白在埃希氏腹水瘤细胞中被发现,属增殖相关蛋白(PA2G4)家族,但目前对其研究甚少,主要集中在同家族的人类同源蛋白Ebp1蛋白功能研究上。Ebp1与p38-2G4具有高度同源性,均含有394个氨基酸残基,仅在4个氨基酸残基上不同,它对细胞增殖,分化,凋亡等功能均具有重要作用。 本文拟通过p38-2G4蛋白在小鼠红系分化过程中的功能研究,阐明该家族蛋白对红系分化的影响,进一步探究红系分化过程。首先通过Western blot检测p38-2G4蛋白在几种小鼠组织和红系细胞中的表达情况。其次利用联苯胺染色检测红系分化过程中血红蛋白的产生和细胞形态的改变,通过Western blot,免疫细胞化学(ICC)和RT-PCR方法分析p38-2G4在小鼠红系分化过程中的变化。此外,通过慢病毒转染MEL细胞改变p38-2G4蛋白在MEL细胞中的表达量,进步研究p38-2G4蛋白水平的改变对MEL细胞增殖和分化的影响。为此,针对p38-2G4mRNA的编码区设计两组干扰序列,构建p38-2G4-shRNA1/2-pLK0.1低表达重组载体,另构建p38-2G4-pLJM1高表达重组载体,分别与包装质粒pCMV-VSV-G和pCMV-dR8.2共转导HEK293T细胞,收集病毒。然后将具有侵染力的病毒颗粒转染MEL细胞,利用嘌呤霉素筛选p38-2G4低表达／高表达的MEL稳定细胞株。通过MTT和细胞计数实验检测p38-2G蛋白水平的改变对MEL细胞增殖的影响。流式细胞实验检测p38-2G4蛋白水平的改变对细胞周期的影响。利用丁酸钠诱导MEL细胞结合联苯胺染色检测p38-2G4蛋白水平改变对MEL细胞诱导红系分化的影响。 Western blot分析结果显示p38-2G4蛋白在小鼠胎肝、FVA、DMSO诱导MEL细胞中均具有差异性表达,结果与之前的双向电泳基本一致.Western blot结果显示p38-2G4蛋白在几种小鼠组织和红系细胞中均有表达,且具有两种亚型,但亚型分布具有组织和细胞特异性。另外,在MEL细胞中进行免疫细胞化学实验确定p38-2G4蛋白主要定位于细胞质而在细胞核中分布甚少。丁酸钠诱导MEL细胞分化系统中,Western blot,RT-PCR实验分析显示p38-2G4在红系分化过程中具有差异性表达,呈下降的变化趋势。此外,Western blot结果显示p38-2G4高表达和低表达的MEL稳定细胞株构建成功。MTT实验和细胞计数实验显示p38-2G4蛋白水平的改变不影响MEL细胞增殖。联苯染色结果显示p38-2G4蛋白水平的改变可降低MEL诱导分化过程中血红蛋白的合成。 上述结果均表明p38-2G4蛋白在小鼠红系分化过程中具有重要作用,但对MEl细胞增殖没有显著性影响,为此,本课题希望能对p38-2G4蛋白参与小鼠红系分化的机制作进一步的探究。目前已成功构建p38-2G4-V51-S3重组载体,拟通过串联亲和纯化技术发现与p38-2G4相互作用的蛋白,从而揭示p38-2G4参与小鼠红系分化的具体机制。
【关键词】：红系分化 p38-2G4 MEL 高表达 干扰
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩略语9-10
• 目录10-13
• 第一章 绪论13-20
• 1 研究背景、目的和意义13-15
• 1.1 研究背景13-15
• 1.1.1 小鼠胎肝红系分化13-14
• 1.1.2 小鼠FVA细胞红系分化14
• 1.1.3 肿瘤细胞的诱导分化14-15
• 1.2 研究目的及意义15
• 2 p38-2G4的研究概况15-18
• 2.1 Ebp1对细胞增殖的影响17
• 2.2 Ebp1对细胞分化的影响17
• 2.3 Ebp1对细胞凋亡的影响17-18
• 3 研究内容及路线18-20
• 第二章 材料和方法20-44
• 1 材料20
• 1.1 细胞株,病毒及动物20
• 1.2 菌株及质粒20
• 2 试剂20-23
• 3 仪器23-24
• 4 试剂配制24-27
• 5 实验方法27-44
• 5.1 小鼠组织样品的制备27
• 5.2 小鼠胎肝样品的制备27-28
• 5.3 小鼠FVA细胞样品的制备28
• 5.4 细胞培养28
• 5.5 免疫印迹28-30
• 5.5.1 蛋白样品的制备28-29
• 5.5.2 Brandford法蛋白定量29
• 5.5.3 Western blot29-30
• 5.6 半定量PCR30-32
• 5.6.1 细胞总RNA的提取30-31
• 5.6.2 RT-PCR(TOYOBO Revertra Ace qRCR RT kit,code No.FSQ-101试剂盒)31
• 5.6.3 半定量PCR31-32
• 5.7 免疫细胞化学32-33
• 5.7.1 细胞样品制备32
• 5.7.2 免疫荧光共聚焦显微技术32-33
• 5.8 高表达重组载体的构建33-35
• 5.8.1 PCR扩增p38-2G4基因33
• 5.8.2 PCR产物的回收33
• 5.8.3 目的片段和质粒的双酶切33
• 5.8.4 酶切产物割胶回收33-34
• 5.8.5 连接34
• 5.8.6 感受态制备34
• 5.8.7 转化34-35
• 5.8.8 PCR鉴定和双酶切鉴定35
• 5.8.9 测序鉴定35
• 5.9 低表达重组载体的构建35-37
• 5.9.1 短发夹p38-2G4-shRNA序列的设计35-36
• 5.9.2 寡核苷酸片段的退火36
• 5.9.3 pLKO.1-TRC克隆载体的双酶切36
• 5.9.4 连接36-37
• 5.9.5 转化37
• 5.9.6 阳性克隆的鉴定37
• 5.9.7 测序鉴定37
• 5.10 慢病毒的包装37-39
• 5.10.1 质粒的大量制备37-39
• 5.10.2 慢病毒包装39
• 5.11 稳定细胞株的筛选及鉴定39-40
• 5.12 生长曲线/MTT检测p38-2G4蛋白对MEL细胞增殖的影响40
• 5.12.1 生长曲线40
• 5.12.2 MTT 实验40
• 5.13 联苯胺染色检测p38-2G4蛋白对MEL细胞分化的影响40
• 5.14 流式细胞术检测p38-2G4蛋白对MEL细胞周期的影响(凯基试剂40-41
• 5.15 p38-2G4的串联亲和纯化41-43
• 5.16 数据分析43-44
• 第三章 结果44-62
• 1 p38-2G4蛋白在不同发育期的胎肝中的表达44-45
• 2 p38-2G4蛋白在FVA细胞中的表达45-46
• 3 p38-2G4蛋白在DMSO诱导MEL细胞分化中的表达46
• 4 p38-2G4在小鼠组织和几种红系细胞中的表达谱46-47
• 5 p38-2G4蛋白的亚细胞定位47-48
• 6 p38-2G4蛋白在丁酸钠诱导MEL细胞分化过程中的表达48-50
• 7 p38-2G4高表达和低表达MEL细胞稳定株的构建及筛选50-53
• 7.1 p38-2G4-pLJM1高表达MEL细胞稳定株的构建及筛选50-52
• 7.1.1 p38-2G4-pLJM 1高表达重组载体构建50-51
• 7.1.2 p38-2G4-pLJM1高表达MEL细胞稳定株的筛选51-52
• 7.2 p38-2G4-pLKO.1低表达MEL细胞稳定株的构建及筛选52-53
• 8 p38-2G4蛋白对MEL细胞增殖的影响53-55
• 8.1 p38-2G4蛋白高表达对MEL细胞增殖的影响53-54
• 8.2 p38-2G4蛋白低表达对MEL细胞增殖的影响54-55
• 9 p38-2G4蛋白对MEL细胞周期的影响55
• 10 p38-2G4蛋白对MEL细胞分化的影响55-59
• 10.1 p38-2G4蛋白高表达对MEL细胞分化的影响56-57
• 10.2 p38-2G4蛋白低表达对MEL细胞分化的影响57-59
• 11 p38-2G4蛋白相关蛋白的研究59-62
• 11.1 p38-2G4-V51-S3重组载体的构建59-60
• 11.2 p38-2G4-V51-S3重组质粒瞬时转染293T细胞60-62
• 第四章 讨论62-64
• 第五章 结论和展望64-65
• 1 结论64
• 2 展望64-65
• 参考文献65-69
• 致谢69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 罗长缨;胎肝造血前体细胞特征及其临床应用的研究进展[J];中国当代儿科杂志;2003年05期

2 李赛,马静,葛晔华,薛社普,韩代书;原红细胞在体外EPO诱导下的增殖分化特征[J];中国组织化学与细胞化学杂志;2003年01期

3 骆一西;孙健;余优成;;Ebp1、E-cadherin、ICAM-1、MMP-9在唾液腺腺样囊性癌中的表达及临床意义[J];上海口腔医学;2013年01期

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本文编号：785546