抗肿瘤19肽在大肠杆菌中的诱导表达及其活性验证

发布时间：2017-09-04 02:29

  本文关键词：抗肿瘤19肽在大肠杆菌中的诱导表达及其活性验证

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【摘要】：抗肿瘤19肽为肿瘤抑素（tumstatin）靠近C端的185-203位氨基酸组成的肽段，具有直接抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的作用。从动物中提取或人工合成抗肿瘤19肽成本较高，随着分子生物学技术的不断发展，运用工程菌生产重组的抗肿瘤19肽将成为未来的一种发展趋势。 本实验将合成的抗肿瘤19肽基因连接到表达载体pET32a上，分别转化到四种大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(DE3)plysS和Rosetta(DE3)中，用IPTG诱导表达重组蛋白。将诱导出的蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，运用1D Gel Image Processing Software（Version5.0.0.16US）软件分析凝胶电泳结果，大约在22kD处有条明显的表达条带,与推测的重组蛋白理论值大小相符，说明目的基因在重组菌中得到了表达，其中在BL21(DE3)菌种中重组蛋白的表达量最高，为18mg/L，命名为pET32a-19肽-BL21(DE3)，作为后续实验的工程菌。 对pET32a-19肽-BL21(DE3)进行传代培养15代，经SDS-PAGE蛋白电泳检测，重组蛋白的表达量没有明显变化，说明质粒遗传稳定；利用单因素实验和正交实验对其发酵条件进行优化，确定最佳发酵条件是培养基pH7.0、接种量3%、IPTG浓度0.1mmol/L、IPTG添加时间OD600=0.7、诱导温度41℃和诱导时间5h，重组目的蛋白的表达量高达54.57mg/L。 通过超声波破碎菌体，离心后的上清和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果显示重组蛋白主要以包涵体的形式表达。通过Ni Sepharose6Fast Flow亲和层析的方法纯化重组蛋白，对纯化出的重组蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，纯度达到95%以上。 通过梯度透析法复性重组蛋白，，真空冷冻干燥后获得重组蛋白干粉。利用MTT的方法进行活性实验，当重组蛋白浓度达到200μg/mL时对人肝癌细胞(SMMC7721)抑制率为70%。
【关键词】：抗肿瘤19肽 表达 纯化 复性 抗肿瘤
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378;Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 第一章 前言6-13
• 1.1 肿瘤抑素6-7
• 1.2 抗肿瘤 19 肽7
• 1.3 国内外研究现状7-8
• 1.4 大肠杆菌表达系统8-9
• 1.5 重组蛋白包涵体9-11
• 1.6 研究的目的和意义11
• 1.7 实验路线11-13
• 第二章 抗肿瘤 19 肽在大肠杆菌中的融合表达13-29
• 2.1 材料与方法13-19
• 2.2 结果与分析19-27
• 2.3 讨论27-28
• 2.4 小结28-29
• 第三章 重组蛋白的纯化与复性29-35
• 3.1 材料与方法29-32
• 3.2 结果与分析32-33
• 3.3 讨论33-34
• 3.4 小结34-35
• 第四章 重组蛋白的抗肿瘤活性研究35-40
• 4.1 材料与方法35-37
• 4.2 结果与分析37-38
• 4.3 讨论38-39
• 4.4 小结39-40
• 结论40-41
• 参考文献41-46
• 作者简介46-47
• 致谢47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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3 王增;马会勤;张文;陈尚武;;包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展[J];中国生物工程杂志;2009年07期

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本文编号：788834