miR-21-4T1细胞的构建及其exosome功能的初步研究

发布时间：2017-09-04 04:38

  本文关键词：miR-21-4T1细胞的构建及其exosome功能的初步研究

  更多相关文章： exosome 4T1细胞株 microRNA-21 免疫抑制 小鼠腹腔巨噬细胞 小鼠骨髓来源树突状细胞

【摘要】：目的：microRNA-21（miR-21）是一种在多种实体瘤中高表达的microRNA，包括乳腺癌，它参与并促进肿瘤的发生、进展。细胞中的microRNA可以分泌到exosome中去。Exosome是一种细胞分泌的膜性纳米小泡。肿瘤分泌的exosome可以通过自分泌方式促进肿瘤细胞的生长，通过旁分泌或者是内分泌方式抑制免疫监视、促进肿瘤细胞的转移，为其生长和进展提供一个有利的环境。为了进一步探讨miR-21是否会通过释放的exosome影响肿瘤微环境，进而影响肿瘤细胞的生长、转移，本实验构建了高表达miR-21的4T1细胞株，初步探究其分泌的exosome对肿瘤细胞以及免疫细胞的影响。 方法： 1构建稳定高表达miR-21的4T1细胞株 利用慢病毒载体构建高表达miR-21的4T1细胞株即miR-21-4T1细胞株，通过实时定量PCR验证该稳转株中miR-21的过表达，荧光显微镜和流式细胞仪检测miR-21-4T1细胞中绿色荧光蛋白表达情况。同时构建空载体对照scramble-4T1细胞。 2miR-21对4T1生物性状的影响 通过细胞增殖活力实验（MTS方法）、划痕实验及Transwell细胞迁移实验分别观察miR-21升高后对4T1细胞增殖、迁移能力的影响。 3exosome的制备 收集72小时体外培养miR-21-4T1细胞的上清，差速离心法分离提取exosome：300×g，10分钟；2000×g，20分钟；10000×g，30分钟；然后将上清超高速100000×g离心120分钟。最后用磷钨酸负染exosome并在透射电子显微镜下观察exosome的形态。 4miR-21-4T1细胞分泌的exosome功能研究 实时定量PCR的方法检测来自miR-21-4T1细胞的exosome中miR-21的相对表达情况。MTS实验、划痕实验、Transwell细胞迁移实验分别观察miR-21-4T1所分泌的exosome对4T1细胞增殖、迁移能力的影响；采用ELISA试剂盒分析其对小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠骨髓来源的DC细胞分泌IL-6、IL-10的影响；流式细胞术分析其对小鼠骨髓来源的DC细胞表面分子MHCⅡ、CD86、CD54表达的影响。 结果： 1实时定量PCR结果显示，利用慢病毒载体构建的miR-21-4T1细胞中miR-21表达水平升高了2.79±0.5411倍。荧光显微镜下发现miR-21-4T1、scramble-4T1细胞中几乎均带有绿色荧光，同样流式细胞术检测的miR-21-4T1、scramble-4T1细胞中绿色荧光蛋白表达率分别能够达到93.58%±0.456、77.06%±0.844。 2MTS结果显示miR-21-4T1细胞与4T1细胞增殖能力没有显著性差异，但在划痕实验和Transwell细胞迁移实验中，miR-21-4T1细胞迁移能力要高于4T1和scramble-4T1细胞。 3利用差速离心方法得到的miR-21-4T1细胞分泌的exosome，通过磷钨酸负染在透射电子显微镜下观察到直径约在40-100nm的椭圆形颗粒，中间淡染，边缘深染。 4经实时定量PCR检测分析后发现，miR-21-4T1细胞分泌的exosome中miR-21表达水平增加了3.49±0.2703倍。 5在增殖实验和划痕实验中，miR-21-4T1分泌的exosome与对照组没有明显的差异。但在Transwell细胞迁移实验中，它所分泌的exosome能够促进4T1细胞迁移。 6miR-21-4T1分泌的exosome可以促进小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-6、IL-10，但是该功能弱于4T1细胞的exosome，且这种作用不受TLR7受体阻断剂所影响。 7miR-21-4T1来源的exosome可以促进小鼠骨髓来源树突状细胞分泌IL-6、IL-10，，减少小鼠骨髓来源树突状细胞表面的MHC II分子表达。 结论： 1过表达的miR-21可以促进4T1细胞的转移能力。 24T1细胞中的miR-21表达升高后，它所分泌的exosome中miR-21水平也会升高。 3过表达miR-21的exosome并没有促进4T1细胞增殖，但是可以促进它的转移能力。 4肿瘤细胞来源的exosome对巨噬细胞和树突状细胞能够起到免疫抑制的作用，但是miR-21升高后并没有明显促进这种抑制作用。
【关键词】：exosome 4T1细胞株 microRNA-21 免疫抑制 小鼠腹腔巨噬细胞 小鼠骨髓来源树突状细胞
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-10
• 前言10
• 材料与方法10-21
• 结果21-23
• 附图23-32
• 讨论32-34
• 结论34-35
• 参考文献35-37
• 综述 肿瘤生长和转移的新途径—exosome37-53
• 参考文献44-53
• 致谢53-54
• 个人简历54

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