基于发卡结构自组装的适体传感器用于检测药物小分子—腺苷

发布时间：2017-09-04 05:13

  本文关键词：基于发卡结构自组装的适体传感器用于检测药物小分子—腺苷

  更多相关文章： 适体传感器 发卡结构自组装 无酶扩增技术 腺苷

【摘要】：生物传感器是一种能将生物识别过程转换为可检测信号的装置,主要包括两个重要的功能性组件：目标物识别组件和信号转导组件。其中,目标物识别组件是影响其传感性能的核心元素。近年来,适体以其高亲和力、高特异性以及广泛目标物等特点引起了人们越来越多的研究兴趣和关注。以适体为识别元件的传感器即适体传感器逐渐成为生命科学的研究热点和研究重点。由于灵敏度高、响应快速和操作简单的优势,荧光法已作为信号转导元件广泛用于各类适体传感器中。因此,本文的研究工作主要集中于如何在现有生物学分析技术基础上构建新型的荧光适体传感器。 腺苷是一种重要的生物药物小分子,参与机体多种生命活动的调节,具有重要的生理和药理作用,如舒张血管、收缩平滑肌以及对神经系统和免疫系统的调节作用,是治疗阵上性心动过速(PSVT)的一线药物。此外,生物样本中腺苷的检测可用于疾病诊断、病程的监测以及癌症的早期诊断。因此对腺苷的定量检测,尤其是生物样本中腺苷的检测在临床研究、疾病的诊断和预防以及癌症的早期诊断等方面具有重要的意义。 自腺苷适体被筛选出来后,基于适体传感器的腺苷检测法得以快速发展。然而,现有的腺苷适体传感系统灵敏度往往不够理想,且不能直接用于复杂生物样本中腺苷的定量检测。因此,进一步提高腺苷检测的灵敏度和实现生物样本中的直接检测是现在腺苷适体传感器所面临的重大挑战。本文中我们利用恒温、无酶的信号放大技术——发卡结构自组装,构建了新型的荧光适体传感器,提高了腺苷的检测灵敏度,实现了生物样本中腺苷的分析检测。 第一章首先对生物传感器进行了综述,尤其是荧光适体传感器的特点、优势及发展。其次,概述了现有的几类等温信号放大技术,重点介绍了基于发卡结构自组装的无酶信号放大技术。随后,对腺苷的重要生理和药理作用进行了介绍。最后,就腺苷适体传感器的发展和面临的挑战进行了概述。 第二章构建了基于发卡结构自组装的新型适体传感系统,成功实现了腺苷的无酶、免标记和双重放大的分析检测。通过设计将杂交链式反应(HCR)引物链部分封闭在发卡H2中,将G-四分体序列分别连接在发卡H3的两端。腺苷的加入可以触发发卡H1和H2进行催化自组装反应(CHA),实现信号的第一步放大；CHA产物所暴露出的HCR引物链可以进一步触发H3和H4进行HCR扩增,实现信号的第二步放大。HCR反应后,原来分为两段的G-四分体序列可以形成完整的G-四分体结构,插入荧光染料NMM后实现检测。在最优实验条件下,该方法对腺苷的线性范围为5.0×10-6mOl L-1-2.O×10-4mOl L-1,检测限为9.7×10-7mol L-1。该检测限较Yu课题组酶辅助放大的腺苷适体传感器降低了约12倍,较本课题组之前构建的无酶、放大的腺苷适体传感器降低了约6倍。所构建的适体传感器能实现均相中腺苷的无酶、免标记和双重放大的定量检测,灵敏度高、特异性好,具有在复杂生物基质中应用的潜能。 虽然我们构建的腺昔适体传感器的灵敏度得到了显著提高,但是该灵敏度仍旧不够理想,不能用于生物样本的直接分析检测。为此,我们开展了下一个工作。第三章构建了基于共区域化触发HCR的腺苷适体传感器,可以用于生物样本中腺苷的直接检测。在该体系中,首先将腺苷适体截为两半,分别连有粘性末端区域和链置换区域,通过腺苷的“粘合”作用使得两个适体片段结合,从而实现粘性末端区域和链置换区域的共区域化,形成完整的引物链,触发HCR反应。在最优实验条件下,该方法对腺苷的线性范围为1.0×10-6mol L-1.2×10-4mOlL-1,检测限为2.0×10-7mol L-1,较Yu课题组酶辅助放大的腺苷适体传感器降低了60倍,较本课题组之前构建的无酶放大的腺苷适体传感器降低了约30倍。该方法无酶、免标记、设计简单、背景低,且能实现生物样本中腺苷的直接检测。此外,通过简单改变适体部分,该平台可用于其它目标物的分析检测,具有较高的通用性。
【关键词】：适体传感器 发卡结构自组装 无酶扩增技术 腺苷
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 符号说明14-15
• 第一章 绪论15-35
• 1.1 引言15
• 1.2 荧光适体传感器15-20
• 1.2.1 识别组件——适体15-16
• 1.2.2 信号转导组件——荧光16-18
• 1.2.3 荧光适体传感器的发展18-20
• 1.3 信号放大技术20-31
• 1.3.1 基于蛋白酶催化的信号放大策略20-26
• 1.3.2 基于脱氧核酶的信号放大策略26-29
• 1.3.3 无酶的信号放大策略29-31
• 1.4 腺苷31-34
• 1.4.1 腺苷的检测意义31-32
• 1.4.2 腺苷主要的检测方法32-33
• 1.4.3 腺苷适体传感器面临的问题33-34
• 1.5 本论文拟开展的工作34-35
• 第二章 基于发卡结构自组装的新型腺苷适体传感器35-55
• 2.1 引言35-36
• 2.2 实验部分36-38
• 2.2.1 仪器装置36
• 2.2.2 试剂36-37
• 2.2.3 实验方法37-38
• 2.2.4 凝胶的制备和电泳实验38
• 2.3 结果与讨论38-54
• 2.3.1 适体传感器的工作原理38-39
• 2.3.2 发卡探针的设计39
• 2.3.3 四分体结构的设计39-41
• 2.3.4 阻滞链的设计41-42
• 2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验42-43
• 2.3.6 体系的荧光图谱43-44
• 2.3.7 反应条件的优化44-50
• 2.3.7.1 适体催化链浓度的优化44-45
• 2.3.7.2 发卡结构的浓度和比例的优化45-48
• 2.3.7.3 反应时间的优化48-49
• 2.3.7.4 NMM的用量优化49-50
• 2.3.8 腺苷的分析检测50-52
• 2.3.9 建立适体传感器的方法学验证52-54
• 2.4 结论54-55
• 第三章 基于共区域化触发的HCR的腺苷适体传感器55-75
• 3.1 引言55-57
• 3.2 实验部分57-58
• 3.2.1 仪器装置57
• 3.2.2 试剂57-58
• 3.3 实验步骤58-60
• 3.3.1 磁球的活化58
• 3.3.2 生物素化DNA的固定58-59
• 3.3.3 腺苷诱导的共区域化59
• 3.3.4 HCR反应59
• 3.3.5 插入SYBR Green I和荧光检测59-60
• 3.4 结果与讨论60-74
• 3.4.1 腺苷诱导共区域化的适体传感器的工作原理60-61
• 3.4.2 适体传感器的设计61
• 3.4.3 配对碱基个数的优化61-62
• 3.4.4 聚丙烯酰胺凝胶的配置与电泳实验62-63
• 3.4.5 荧光实验验证63
• 3.4.6 系统条件优化63-67
• 3.4.7 腺苷的分析检测67-68
• 3.4.8 建立适体传感器的方法学验证68-70
• 3.4.9 生物样本中的分析应用70-74
• 3.4.9.1 尿样中腺苷的校准曲线70-72
• 3.4.9.2 尿样中腺苷分析检测的方法学验证72-73
• 3.4.9.3 尿样中腺苷的检测73-74
• 3.5 结论74-75
• 参考文献75-90
• 致谢90-91
• 硕士期间发表论文91-92
• 学位论文评阅及答辩情况表92

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 陈秀英,彭孝军;DNA分子荧光探针[J];染料与染色;2004年06期

2 吕武清,颜华荣,龙新华;薄层扫描法测定金水宝胶囊中腺苷的含量[J];中草药;1996年01期

3 朱文玲;腺苷在心血管病诊治中的应用前景[J];中华心血管病杂志;2004年10期

4 王文昭;赵欣捷;李响;陈静;李方楼;许国旺;;尿中修饰核苷代谢轮廓分析在肺癌诊断中的作用[J];中国医学科学院学报;2007年06期

5 滕红;;腺苷在心血管疾病中的应用[J];中国实用医药;2011年24期

，

本文编号：789536