微生物来源结核分枝杆菌蛋白激酶B抑制剂筛选模型的建立和应用

发布时间：2017-09-05 12:40

  本文关键词：微生物来源结核分枝杆菌蛋白激酶B抑制剂筛选模型的建立和应用

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【摘要】：肺结核(TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteria tuberculosis, Mtb)引起的一种严重威胁人类健康的慢性传染病,世卫组织《2013年全球结核病报告》中表明2012年结核病病人数为860万人,全球结核病死亡数130万,尽管感染人数和死亡人数均呈现缓慢下降趋势,但仍面临着结核分枝杆菌产生耐药性的危机。同时,抗结核药物研发进展的缓慢更加剧了结核防治任务的艰巨性。因此,开发针对新颖靶点的抗结核药物已经迫在眉睫。 结核分枝杆菌中存在11种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknA-PknL (STPKs)[1],其中PknB广泛参与到了有关结核分枝杆菌生长繁殖的信号转导途径,在结核分枝杆菌生长分裂和细胞形态的调节中发挥着重要作用,为结核分枝杆菌生存所必需,可作为抗结核药物的筛选靶点之一 本研究表达纯化了PknB的N端激酶结构域蛋白,并以其为靶标建立并优化了适用于微生物发酵液样品筛选的、以NADH比色法为基础的PknB抑制剂高通量筛选模型,此模型与本实验室已经建立的以萤光素酶法为基础的PknB抑制剂筛选模型相比,最大的优点在于反应体系在最后的结果检测中不受样品颜色的干扰,可用于筛选颜色较深的发酵液样品。 本研究利用该模型筛选了20000个发酵液样品,得到阳性发酵液样品56个,其中5株阳性菌株I10A-00359、I10A-00827、I11A-01925、I11A-02040、I11A-02296的发酵液样品对结核分枝杆菌PknB酶活和耻垢分枝杆菌、海分枝杆菌、结核分枝杆菌的生长均具有抑制作用。其中,阳性样品I10AA-00359、I11AA-01925和I11AA-02296具有较低的细胞毒性。 本研究为考察这五个阳性样品的酶活抑制选择性,表达了结核分枝杆菌PknH、PknF和人的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT-1,分别建立和优化了各蛋白的酶活测定方法。结合实验室原有的工作,初步建立了结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶酶活抑制特异性的评价体系。研究结果发现样品I10AA-00359、I10AA-00827, I11AA-02040和I11AA-02296的酶活抑制选择性较好。 最后,本研究对5个阳性发酵液样品进行了初步的分离,并对分离后各部份进行了抑酶、抗菌活性的测定和细胞毒性及酶活抑制选择性的评价。结果显示,I11A-02040菌株发酵液上清和菌丝体甲醇抽提后正丁醇萃取部份(D、H)以及I10A-00827菌株发酵液上清正丁醇萃取部份(D)具有良好的抑酶、抗菌活性,并具有较小的细胞毒性和较好的酶活抑制选择性,为后续活性物质的分离纯化奠定了初步的基础。
【关键词】：结核分枝杆菌 PknB 微生物发酵液 抑制剂
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-9
• Abstract9-10
• 前言10-12
• 实验材料12-21
• 实验方法21-45
• 一、基于NADH比色法以PknB为靶点的高通量筛选模型的建立和优化21-31
• 1 重组质粒pET28a-pknB-N、pET30a-garA在大肠杆菌中的诱导表达21-25
• 2 目的蛋白的纯化25-27
• 3 结核分枝杆菌重组蛋白PknB-N酶活性检测方法的建立27-28
• 4 结核分枝杆菌重组蛋白PknB-N酶活测定体系的优化28-30
• 5 待测样品对PknB-N抑制作用的测定30-31
• 6 假阳性结果的排除31
• 二、结核分枝杆菌PknB抑制剂细胞水平的性质评价31-33
• 1 微稀释法检测酶水平阳性样品的抗菌活性31-32
• 2 MTT比色法检测阳性发酵液样品对细胞存活的影响32-33
• 三、阳性发酵液样品体外酶活抑制选择性评价体系的建立及应用33-43
• 1 阳性发酵液样品对结核分枝杆菌肽脱甲酰基酶(PDF)酶活抑制性评价33-34
• 2 结核分枝杆菌蛋白激酶H、蛋白激酶F、人蛋白激酶AKT-1的诱导表达34-40
• 3 基于NADH比色法的结核分枝杆菌重组蛋白PknH、PknF和人的重组蛋白AKT-1酶活性检测方法的建立40-43
• 四、阳性菌株次级代谢产物的初步处理及活性测定43-45
• 1 五株阳性菌株I10A-00359、I10A-00827、I11A-01925、I11A-02040、I11A-02296的发酵43
• 2 五株阳性菌株发酵产物的初步处理43-45
• 实验结果及讨论45-71
• 一、基于NADH比色法以PknB为靶点的高通量筛选模型的建立和优化45-52
• 1 结核分枝杆菌重组PknB-N、GarA的表达与纯化45-46
• 2 结核分枝杆菌重组PknB-N酶活性检测体系的优化46-51
• 3 发酵液样品酶水平的筛选51-52
• 二、复筛阳性发酵液样品细胞水平的活性和毒性评价52-53
• 1 复筛阳性发酵液样品的处理52
• 2 复筛阳性发酵液样品抗菌活性评价52-53
• 3 复筛阳性发酵液样品细胞毒性评价53
• 三、阳性发酵液样品体外酶活抑制选择性评价体系的建立53-66
• 1 pET28a-pknH、pET28a-pknF、pET28a-akt-1质粒的构建53-55
• 2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及目的蛋白的诱导表达后可溶性评价55-56
• 3 目的蛋白的纯化56-57
• 4 基于NADH比色法PknH、PknF、AKT-1蛋白酶活测定体系的建立57-65
• 5 复筛阳性发酵液样品的酶活抑制选择性评价65-66
• 四、复筛阳性菌株次级代谢产物的初步处理及活性测定66-71
• 1 五株阳性菌株发酵产物的初步处理66
• 2 五株阳性菌株发酵产物初分后各部份的活性测定及结果分析66-71
• 小结71-72
• 参考文献72-75
• 文献综述75-85
• 参考文献82-85
• 致谢85

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 高鹏;肖春玲;姜威;蒋建东;;Ser/Thr蛋白激酶信号转导系统——抗结核药物筛选的新靶点[J];国外医药(抗生素分册);2007年02期

2 唐先兵,司书毅,张月琴;肠球菌肽脱甲酰基酶在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达及其活性检测[J];中国生物工程杂志;2004年03期

3 张丽蓉;赵莉莉;魏玉珍;李秋萍;王莉宁;余利岩;;以肽脱甲酰基酶为靶点的抗结核药物高通量筛选模型的建立和应用[J];中国医药生物技术;2012年02期

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本文编号：798034