茵陈蒿汤对胆汁性肝纤维化大鼠模型肝卵圆细胞的影响

发布时间：2017-10-09 05:27

  本文关键词：茵陈蒿汤对胆汁性肝纤维化大鼠模型肝卵圆细胞的影响

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【摘要】：一、背景和目的 肝纤维化是由多种致病因子所致的肝内结缔组织异常增生,是一动态发展过程,是各种肝脏疾病最终发展成肝硬化的必经病理阶段,具有可逆性。在肝胆外科临床中,胆管梗阻、胆汁淤积是比较常见的病理环境,较长时间的梗阻,可诱发永久性肝损害,甚至发展成肝纤维化及胆汁性肝硬化,严重危害患者的生活质量及生存率。近年来虽然对胆汁淤积性肝纤维化发病机制的研究有了进一步的认识,但仍是临床治疗的难题。部分患者即使接受了成功的胆汁引流手术,黄疸消退缓慢,肝功能恢复不良,术后并发症发生率高,使得患者平均住院天数延长,治疗费用增加,心理负担加重,因此,早期预防和阻断肝进行性纤维化是治疗的关键所在。 既往研究发现各种慢性肝脏疾病的发生发展与类似于卵圆细胞的肝前体细胞的活化有密切的关系。这种肝前体细胞主要定位于汇管区、纤维间隔、汇管区旁肝实质、假小叶及炎症边界,具有增殖分化为成熟肝实质细胞和胆管上皮细胞的双潜能。随着大鼠肝卵圆细胞特异性标记物0V-6的发现,卵圆细胞相关研究成为了热点。特别是肝卵圆细胞参与肝脏的损伤修复、肝脏纤维化的相关研究。这些理论为研究肝脏损伤的保护、治疗及肝纤维化的形成机制提供了最新途径。 胆汁淤积性肝纤维化属于中医“黄疸”的范畴。茵陈蒿汤出自东汉·张仲景《伤寒论》,由茵陈、栀子和大黄组成,具有清热利湿退黄之功效,是治疗湿热黄疸的主方。现代研究表明,茵陈蒿汤具有利胆、保肝、解热、抗炎、镇痛、抗菌、抗病毒等作用。近年来对茵陈蒿汤抗肝纤维化机制的相关研究屡见不鲜。 因此,本研究的主要目的是通过结扎Wistar大鼠胆总管,模拟胆管梗阻胆汁淤积肝纤维化病理状态,采用免疫组化、PCR技术,观察茵陈蒿汤对实验性大鼠肝纤维化肝卵圆细胞增殖的影响和肝星状细胞激活的调节,探讨茵陈蒿汤在保肝和抗肝纤维化中的作用,为临床治疗胆汁淤积性肝纤维化提供一定的理论依据。 二、材料与方法 雄性Wistar大鼠40只随机分成四组,即假手术对照组(10只)、胆总管结扎组(10只)、再通组(10只)和再通+中药干预组(10只)。假手术对照组仅作胆总管分离,不作胆总管结扎,其余各组采用胆总管结扎制备胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型,胆总管结扎术后第7天、第10天分别行胆道再通,再通术后第1天同时分别给予中药灌胃和等量生理盐水灌胃3天。各组大鼠术后相同条件下饲养。假手术对照组和胆总管结扎组分别于术后第7天、第10天两个时相点处死大鼠,再通组和再通+中药干预组分别于再通术后第3天处死大鼠,每组各处死5只。肝脏标本：取肝右叶应用10%福尔马林固定留作免疫组化；取肝左叶-80℃冻存留作RT-PCR检测。 1、通过肉眼及HE染色分别观察胆管梗阻不同时相点肝组织形态学改变。 2、通过免疫组化,OV-6标记肝卵圆细胞,动态观察不同时相点肝卵圆细胞的数目及分布范围。 3、通过RT-PCR检测各目的基因mRNA的表达：α-平滑肌动蛋白(α-SMA)及I型胶原蛋白(COL Ⅰ),动态观察不同时相点各基因的表达情况。 三、结果 1、大体结果 (1)假手术对照组：肝脏标本各肝叶色泽红润,表面光滑。 (2)胆总管结扎组：Wistar大鼠胆管结扎后可见肝脏逐渐黄染并肿胀,部分质地变硬,肝脏淤血、水肿,10%福尔马林固定大鼠肝叶标本后,可见表面粗糙,颜色灰白等肝组织早期纤维化的表现,并随着梗阻时间的延长而加重。 (3)再通组：肝脏淤胆肿胀程度较再通组有所减轻。 (4)再通+中药干预组：肝脏病变与再通组相比肉眼无明显改善。 2、HE染色结果 (1)假手术对照组：未见炎性细胞浸润、亦未见肝细胞变性、坏死等。 (2)胆总管结扎组：胆管结扎术后第7天肝小叶结构完整,可见炎性细胞浸润,肝细胞肿胀,少数出现变性坏死,重者见片状出血和坏死,肝组织汇管区可见胆管增生和纤维细胞增生性改变；术后第10天肝小叶结构受到破坏,可见肝细胞空泡变性及坏死,纤维化程度逐渐加重。 (3)再通组：胆道再通术后肝细胞变性、坏死、肿胀程度减轻,肝组织仍可见炎性改变及部分纤维化。 (4)再通+中药干预组：与再通组相比,该组大鼠肝脏病变情况有所减轻。 3、免疫组化结果 OV-6阳性细胞表达部位主要分布于汇管区胆管、纤维间隔、肝间质新增生胆管及无管腔的小胆管细胞胞浆中。OV-6免疫组化阳性染色的细胞数目及分布范围随着梗阻时间的延长而增加。应用IDA-2000高清晰度数码显微图象分析系统对阳性细胞着色面积进行统计分析,假手术对照组在各时相点有极少量阳性表达,胆总管结扎组OV-6阳性细胞表达面积在造模后第7天、第10天均较假手术对照组相应时相点增加,差异有统计学意义(P0.05)。与胆总管结扎组比较,造模7天后再通组OV-6阳性细胞表达面积有所增加,造模10天后再通组OV-6阳性细胞表达面积亦有所增加,但差异没有统计学意义(P0.05)。再通+中药干预组OV-6阳性细胞表达面积在相应时相点均较再通组增加,差异有统计学意义(P0.05)。 4、RT-PCR结果 应用2-ΔΔCt法分析基因相对表达量。结果如下：第7天胆总管结扎组α-SMA mRNA的相对表达量与假手术对照组相比升高了6.72倍,差异有统计学意义(P0.05),再通组α-SMA mRNA的相对表达量比假手术对照组升高了2.59倍,而再通+中药干预组α-SMA mRNA的相对表达量只比假手术对照组升高了1.38倍,差异没有统计学意义(P0.05)：与假手术对照组相比,第10天胆总管结扎组α-SMA mRNA (?)的相对表达量显著增高到13.38倍,差异有统计学意义(P0.05),而再通组α-SMA mRNA表达升高了5.94倍,再通+中药干预组α-SMA mRNA的相对表达量只升高了1.56倍,差异不显著(P0.05),再通+中药干预组第7天与再通组相应时相点比较,差异没有统计学意义(P0.05),再通+中药干预组第10天与再通组相应时相点比较,差异有统计学意义(P0.05),而再通+中药干预组与胆总管结扎组各时相点相比,差异有统计学意义(P0.05)。胆总管结扎组COL1mRNA表达在第7天较假手术对照组升高了9.94倍,差异有统计学意义(P0.05),第10天时进一步升高至10.71倍,差异有统计学意义(P0.05);再通组COL1mRNA表达在第7天较对假手术对照组升高了3.95倍,第10天升高至5.41倍,差异没有统计学意义(P0.05);再通+中药干预组在第7天和第10天与假手术对照组相比改变不明显,再通+中药干预组第7天与再通组相应时相点比较,差异没有统计学意义(P0.05),再通+中药干预组第10天与再通组相应时相点比较,差异有统计学意义(P0.05),而再通+中药干预组与胆总管结扎组各时相点相比,差异有统计学意义(P0.05)。可见,α-SMA和COL1基因相对表达量随着胆管结扎天数的增加而逐渐升高；再通术后早期再通较晚期再通α-SMA和COL1基因相对表达量减少；α-SMA和COL1基因表达变化趋势在各组中具有一致性；茵陈蒿汤可以使胆汁性肝纤维化大鼠模型α-SMA mRNA和COL1mRNA表达呈明显下降的趋势。 四、结论 1、本实验通过结扎肝外胆管造成胆管梗阻,成功复制了胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型,观察了不同时相点肝脏的病理学改变,证实随着胆管梗阻时间的延长,其肝脏胆汁淤积性、纤维化程度呈进行性加重趋势,茵陈蒿汤在减轻肝纤维化大鼠的肝脏病理损伤方面优于单纯再通,可以促进再通术后肝脏的病理和功能改善。 2、本实验通过免疫组化研究发现茵陈蒿汤可以通过上调胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型肝组织中OV-6的表达,促进肝卵圆细胞的增殖,改善肝纤维化的进程。 3、本实验通过RT-PCR研究发现茵陈蒿汤可以抑制肝纤维化大鼠肝组织中α-SMA和COL1基因的表达,可能在一定程度上减缓肝纤维化的程度。 4、本实验研究发现肝纤维化的形成是一个多因素参与的复杂过程,茵陈蒿汤具有上调肝卵圆细胞OV-6的表达,促使胶原蛋白沉积降解以及肝星状细胞凋亡的作用,这可能是茵陈蒿汤减缓肝纤维化进程的机制之一。
【关键词】：茵陈蒿汤 胆管结扎肝纤维化 卵圆细胞 肝星状细胞 α-平滑肌动蛋白 Ⅰ型胶原蛋白
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R285.5;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-13
• 目录13-14
• 缩略语/符号说明14-15
• 前言15-17
• 研究现状、成果15-16
• 研究目的、方法16-17
• 1.1 对象和方法17-23
• 1.1.1 实验动物17
• 1.1.2 主要设备材料、试剂及中药17-18
• 1.1.3 实验动物分组及模型制作18
• 1.1.4 标本采集及保存18
• 1.1.5 观察指标和方法18-23
• 1.1.6 统计学分析23
• 1.2 结果23-34
• 1.2.1 大体形态学结果23
• 1.2.2 HE染色结果23-25
• 1.2.3 免疫组化结果25-27
• 1.2.4 RT-PCR结果27-34
• 1.3 讨论34-38
• 结论38-39
• 参考文献39-42
• 发表论文和参加科研情况说明42-43
• 附图43-45
• 综述45-55
• 综述参考文献51-55
• 致谢55

【参考文献】

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本文编号：998403