牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其E0核酸疫苗与细胞因子佐剂联合免疫研究

发布时间：2017-03-29 18:14

  本文关键词：牛病毒性腹泻病毒的分离鉴定及其E0核酸疫苗与细胞因子佐剂联合免疫研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牛病毒腹泻/粘膜病病毒(BVDV/MD)是黄病毒科瘟病毒属的成员,可引起牛病毒性腹泻(BVD),呈世界性分布。由于持续性感染及母牛的繁殖障碍,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。目前,国内还没有商品化疫苗,因此急需研制出新型理想的疫苗防制该病。BVDV的结构蛋白E0保守性高,其上有中和表位。故本研究针对地方株BVDV-TC的E0基因及两种细胞因子基因构建的重组真核表达质粒,来研究核酸疫苗与细胞因子佐剂的联合免疫效果。首先,本研究分离出牛病毒性腹泻新疆株并命名为BVDV-TC,利用RT-PCR分别扩增出BVDV-TC的E0及牛粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因片段,插入到pVAX1载体,构建真核表达质粒。然后利用脂质体2000将各重组质粒转染至BHK-21细胞进行瞬时表达,RT-PCR和Western blot实验分析显示,E0基因的真核重组表达质粒都成功转染至BHK-21细胞,并进行了表达;MTT实验表明细胞因子GM-CSF重组质粒转染组细胞的培养物可刺激淋巴细胞增殖,具有良好的生物学活性。给健康小鼠分别免疫接种如下重组质粒:仅注射pVAX1-E0、pVAX1-E0分别与实验室以构建好的pVAX1-IL-2;pVAX1-GM-CSF;pVAX1-GM-CSF和pVAX1-IL-2共同免疫小鼠,并将空载体pVAX1作为对照组。通过间接ELISA及MTT实验检测免疫小鼠血清中特异性E0抗体及脾淋巴细胞的增殖水平,与对照组相比,接种真核重组质粒的小鼠E0抗体水平及淋巴细胞增殖水平都有所提高(P0.01)。而pVAX1-IL-2和pVAX1-GM-CSF共同免疫组则表现出更强的免疫刺激活性。本研究成功构建了牛病毒性腹泻核酸疫苗及细胞因子佐剂,可以刺激产生细胞和体液免疫,且具有明显的免疫佐剂效应。这为牛病毒性腹泻的新型高效的核酸疫苗的研发提供了理论和实验数据。
【关键词】：牛病毒性腹泻病毒 E0基因 真核表达 细胞因子 核酸疫苗
【学位授予单位】：新疆农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65;S852.4
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-7
• 英文缩略词表7-8
• 第1章 引言8-20
• 1.1 BVDV的生物学特性8-9
• 1.2 BVDV的基因组和编码蛋白9-11
• 1.3 临床症状11-12
• 1.4 检测方法12-13
• 1.5 BVD的防控13-16
• 1.6 提高DNA疫苗免疫效果的策略16-19
• 1.7 研究的目的和意义19-20
• 第2章 BVDV-TC株的分离鉴定20-31
• 2.1 材料20-21
• 2.2 样品鉴定21-24
• 2.3 病毒分离培养24-25
• 2.4 病毒分离鉴定25-26
• 2.5 结果26-29
• 2.6 讨论29-31
• 第3章 BVDV-TC株E0真核表达载体的构建31-43
• 3.1 材料31-32
• 3.2 实验方法32-37
• 3.3 结果37-40
• 3.4 讨论40-43
• 第4章 牛GM-CSF基因的克隆和生物学活性的鉴定43-52
• 4.1 材料43-44
• 4.2 实验方法44-47
• 4.3 结果47-50
• 4.4 讨论50-52
• 第5章 核酸疫苗pVAX1-E0与细胞因子联合免疫效果研究52-58
• 5.1 材料和试剂52
• 5.2 实验方法52-54
• 5.3 实验结果54-56
• 5.4 讨论56-58
• 第6章 结论58-59
• 参考文献59-65
• 致谢65-66
• 作者简介66

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