鹅TLR7和TLR21抗病毒免疫学特性及功能初探

发布时间：2017-04-07 22:09

  本文关键词：鹅TLR7和TLR21抗病毒免疫学特性及功能初探，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Toll样受体作为一种重要的模式识别受体,能够识别多种病原相关分子模式。大量研究报道表明,禽类的TLR3、TLR7与TLR21参与机体的抗病毒免疫反应。水禽鹅,作为许多病原的天然宿主,其抗病毒免疫反应值得做深入研究。本研究首次对鹅TLR7 (GoTLR7)与鹅TLR21 (GoTLR21)的抗病毒免疫学特性进行研究。通过使用低致病性禽流感病毒(H9N2)与鹅细小病毒(GPV)对3日龄雏鹅进行人工感染,检测其主要免疫器官及其他相关器官发现：在感染H9N2病毒后的第3天到第7天,GoTLR7在肺组织的相对表达量显著高于对照组,特别是在第7天其表达量上调了约5倍,但在第一天实验组与对照组无显著差异；在小肠组织中,两组之间GoTLR21与GoTLR7表达量均无显著差异。RIG-I受体作为另外一种非常重要的模式识别受体,负责识别病毒的特定RNA。在H9N2感染第3天鹅的肺和小肠组织中GoRIG-I表达量显著高于对照组。在H9N2感染过程中,干扰素诱导小分子(MX,OAS, PKR)表现出不同的变化规律：MX在所有组织中均无显著变化；OAS在法氏囊、哈氏腺与肺组织的表达量显著高于对照组；PKR在肺组织表达量显著上调,但其在胸腺组织显著下调。GPV感染雏鹅后：GoTLR7在所有组织均无显著变化；GoTLR21在脾脏和胸腺显著升高,而在其他组织并无显著变化；干扰素诱导的抗病毒小分子OAS在小肠组织表达量显著高于对照组,而在其他组织无显著变化；GoRIG-I、GoMX与GoPKR在各组织的相对表达量与对照组相比均无显著差异。因此,结果表明GoTLR7与GoRIG-I参与宿主的抗H9N2流感病毒感染的免疫反应,并诱导抗病毒小分子的产生。GoTLR21参与宿主抗GPV病毒感染的免疫反应,诱导抗病毒小分子的产生。此外,我们还建立了体外感染模型,分别使用H9N2与GPV刺激鹅外周血单核细胞。用定量RT-PCR的方法检测H9N2感染8h时GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游调控干扰素诱导小分子MX、OAS与PKR水平,结果显示：实验组GoTLR7与GoRIG-I的表达量显著性升高,而GoTLR21无任何变化；干扰素诱导小分子MX呈现显著下降,而OAS与PKR均表现出显著上升。用定量RT-PCR的方法检测GPV感染8h时GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游调控干扰素诱导小分子MX、OAS与PKR水平,结果显示：GoTLR7、GoTLR21、GoRIG-I及其下游调控MX、OAS与PKR转录水平与对照组相比均无显著差异。结果表明GoTLR7与GoRIG-I在体外参与了抗H9N2流感病毒感染的免疫反应,并诱导抗病毒小分子的产生。GPV感染PBMC后,GoTLR21与其他免疫相关基因均无显著性变化,我们猜测可能是由于GPV病毒需要更长的时间才能引起TLR21受体的识别,从而产生抗病毒因子,本实验作用时间为8小时不能有效的诱导宿主经由TLR21的抗病毒反应。为了进一步探讨GoTLR7与GoTLR21是否具有抗病毒免疫学活性,我们构建了真核表达质粒PEGFP-C1-GoTLR7与pDs-Red1-N1-GoTLR21并转染传代鸡胚成纤维细胞(DF-1)10h,然后孵育新城疫病毒(New castle disease virus, NDV),经绝对定量PCR反应及病毒滴度检测而观察转染GoTLR7与GoTLR21质粒是否对DF-1细胞中NDV的增殖或复制存在影响。GoTLR7与GoTLR21真核表达质粒分别转染DF-1细胞,而后孵育NDV病毒,研究结果显示：孵育NDV病毒12h后转染有GoTLR7细胞中NDV的复制受到显著的抑制,而转染GoTLR21并未对病毒增殖造成影响；孵育NDV病毒24h时,实验组与对照组的病毒拷贝数均有所上升,但是转染GoTLR7组中NDV拷贝数及TCIDso数值均显著低于对照组,而转染GoTLR21组中病毒增殖情况与对照组比较仍无显著差异。因此,本实验再次验证GoTLR7参与抗RNA病毒免疫反应,并能抑制RNA病毒NDV的复制,而GoTLR21并不参与此反应。大量研究表明哺乳动物抗病毒TLR分布于细胞内的核内体。为了验证禽类抗病毒TLR的细胞分布,我们将真核表达质粒PEGFP-C1-GoTLR7分别转染DF-1、GEF与BHK21。24h后对细胞核进行染色发现GoTLR7在DF-1、BHK21与GEF上的细胞定位不同,具体表现为：DF-1和BHK21细胞中GoTLR7荧光信号集中分布于细胞核一侧,呈现极化状态；而GEF细胞上GoTLR7荧光信号围绕分布于细胞核周围,非分布于细胞核一侧。我们分别采集PEGFP-C1-GoTLR7转染BHK21细胞24h、48h与72h时的图片发现：GoTLR7的细胞定位随表达时间发生了变化,具体表现为：24h时,GoTLR7分布于细胞核的一侧,而在48h及72h, GoTLR7绿色荧光集中分布于远离细胞核的胞质内,呈现球形,推测其定位于某细胞器。将真核表达质粒pDs-Redl-N1-GoTLR21分别转染DF-1、GEF、MDCK与BHK21。24h后对细胞进行染色,发现在不同细胞类型上GoTLR21分布特征一致,均表现为紧紧围绕于细胞核周围。分别采集pDs-Red1-N1-GoTLR21转染BHK21 24h、48h与72h的图片发现,GoTLR21的细胞定位随表达时间也发生了变化。具体表现为：转染24h时,GoTLR21红色荧光表现为紧紧围绕细胞核周围,呈现圆圈状特征,而在48h时发现其浓缩为圆点状,且远离细胞核分布,到72h时其形状再次变为环形。因此,我们推测GoTLR7与GoTLR21也定位于细胞内的细胞器上,内质网或者核内体上。综上,本研究为鹅抗病毒TLR的抗病毒免疫学特性及生物学功能研究奠定基础,为研发新型佐剂及抗病毒生物制剂提供理论基础。
【关键词】：GoTLR7 GoTLR21 细胞定位 抗病毒免疫学特性
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.33
【目录】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-8
• 缩略词表8-13
• 第一部分 文献综述13-19
• 1 TLR7与TLR21的免疫学与生物学特点13-15
• 2 TLR7与TLR21抗病毒免疫学特性及细胞定位研究15-17
• 2.1 Toll样受体抗病毒相关免疫学特性研究进展15-17
• 2.2 TLR7与TLR21的细胞定位研究进展17
• 3 本实验的研究目的及意义17-19
• 第二部分 试验研究19-54
• 第一章 H9N2与GPV对雏鹅先天性免疫基因的影响19-29
• 1 实验材料20-21
• 1.1 实验动物与毒株20
• 1.2 实验仪器与设备20
• 1.3 实验试剂20-21
• 2 实验操作方法与步骤21-23
• 2.1 实验动物分组及处理21
• 2.2 组织处理及RNA提取21-22
• 2.3 引物设计及RT-PCR实验原理22-23
• 3 实验结果23-27
• 3.1 H9N2病毒感染雏鹅引起的TLRs等相关免疫基因的表达量变化23-25
• 3.2 GPV病毒感染雏鹅引起的TLRs等相关免疫基因的表达量变化25-27
• 4 讨论27-28
• 5 本章小结28-29
• 第二章 H9N2与GPV对鹅外周血单核细胞先天免疫基因的影响29-35
• 1 实验材料29-30
• 1.1 实验动物及毒株29
• 1.2 实验仪器和设备29
• 1.3 实验试剂29-30
• 2 实验方法与操作30-31
• 2.1 鹅外周血单核细胞的分离及病毒感染30-31
• 2.2 RNA的提取及引物设计31
• 3 实验结果31-33
• 3.1 H9N2低致病性禽流感感染鹅外周血单核细胞31-32
• 3.2 鹅细小病毒GPV感染鹅外周血单核细胞32-33
• 4 讨论33-34
• 4.1 H9N2对鹅外周血单核细胞先天免疫分子的影响33-34
• 4.2 GPV对鹅外周血单核细胞先天免疫分子的影响34
• 5 本章小结34-35
• 第三章 GoTLR7与GoTLR21的抗NDV病毒活性初探35-45
• 1 实验材料35-37
• 1.1 实验毒株与细胞35
• 1.2 实验仪器与设备35
• 1.3 实验试剂35-36
• 1.4 相关溶液的配制36-37
• 1.5 DH5α感受态细胞的制作37
• 2 实验方法与操作37-41
• 2.1 真核表达质粒PEGFP-C1-GoTLR7的构建37-38
• 2.2 真核表达质粒pDs-Red1-N1-GoTLR21的构建38-39
• 2.3 NDV病毒感染DF-1细胞步骤39-40
• 2.4 NDV拷贝数绝对定量检测方法的建立40-41
• 2.5 转染质粒后的NDV在DF-1细胞上的拷贝数与TCID_(50)的测定41
• 3 实验结果41-43
• 3.1 NDV标准曲线41-42
• 3.2 瞬时过表达GoTLR7与GoTLR21对NDV拷贝数的影响42
• 3.3 瞬时过表达GoTLR7与GoTLR21对NDV TCID_(50)的影响42-43
• 4 讨论43-44
• 5 本章小结44-45
• 第四章 鹅TLR7和TLR21的细胞定位研究45-54
• 1 实验材料45-46
• 1.1 实验试剂与细胞45
• 1.2 实验仪器与设备45-46
• 2 实验方法与操作46-49
• 2.1 GoTLR7细胞定位研究的实验方法与步骤46-48
• 2.2 GoTLR21细胞定位研究的方法与步骤48-49
• 3 试验结果49-52
• 3.1 GoTLR7在不同细胞类型上的细胞定位49
• 3.2 GoTLR7细胞定位随转染时间的变化49-50
• 3.3 GoTLR21在不同细胞类型上的细胞定位50-51
• 3.4 GoTLR21细胞定位随转染时间的变化51-52
• 4 讨论52-53
• 5 本章小结53-54
• 第三部分 结论54-55
• 参考文献55-59
• 致谢59-60
• 作者简介及发表论文情况60
• 作者基本情况60
• 发表论文情况60

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本文编号：291421