同时识别1和3型鸭甲肝病毒的单抗及胶体金试纸条研究

发布时间：2017-04-08 06:06

  本文关键词：同时识别1和3型鸭甲肝病毒的单抗及胶体金试纸条研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸭甲型肝炎病毒(DHAV)可引起雏鸭发生急性、高度致死性传染病。主要感染3周龄以下的雏鸭,其中1周龄以内的雏鸭死亡率高达95%,主要特征病变为患病鸭的肝脏肿大和出血。本试验开展了DHAV病毒单克隆抗体及胶体金试纸条制备和快速诊断等研究,结果如下：1.DHAV单克隆抗体的制备及初步鉴定用血清1型鸭甲型肝炎病毒(DHAV-1) X株病毒尿囊液接种鸭胚,收集24-72h死亡的鸭胚尿囊液,将含DHAV-1病毒的尿囊液与等量的氯仿混合,抽提3次,除去脂类以及一些杂蛋白,然后在40000 r/min离心2 h,用PBS重悬病毒并使病毒蛋白含量为0.5 mg/mL,作为制备单克隆抗体的抗原免疫6周龄的BALB/c雌性小鼠。取免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤进行了细胞融合、筛选,再用有限稀释法对杂交瘤细胞进行3次亚克隆,最终得到5株可以稳定分泌特异性抗体的阳性杂交瘤细胞,分别命名为1#、2#、3#、4#}和5#杂交瘤细胞株。经鉴定,1#单克隆抗体类型属于IgM,2#单克隆抗体类型属于IgG1,3#单克隆抗体类型属于IgG2b,4#和5#单克隆抗体类型属于IgG2a。纯化后单抗腹水的效价均在2×105以上;5株杂交瘤细胞株稳定性均较好,经过体外传代以及细胞冻存复苏仍能稳定分泌抗体。5株单克隆抗体的相对亲和常数都在109数量级以上,具有较好的抗原结合能力,其中3#单克隆抗体的亲和力更高。2.胶体金试纸条的研制及应用用纯化的2#单克隆抗体进行胶体金标记制备成金标抗体,经过试验条件的优化,确定了胶体金与抗原的最佳标记量为34μg/mL,最佳标记的pH值确定0.1mol/L K2CO3加入量为12μL/mL;将纯化的兔抗DHAV-1多抗包被于NC膜的T线上作为检测线,羊抗鼠IgG包被于NC膜的C线上作为对照线,制成双抗体夹心法检测DHAV的胶体金免疫层析试纸条。对胶体金试纸条T线和C线浓度的优化,确定检测线上的兔抗DHAV-1多抗的最佳标记量为1 mg/mL,对照线上羊抗鼠IgG最佳标记量为1 mg/mL。在特异性试验中,检测4株DHAV-1和6株DHAV-3呈阳性反应,对鸭常见的其它致病病原(鸭瘟病毒、鸭大肠杆菌、鸭坦布苏病毒、鸭沙门氏菌、鸭疫里默氏杆菌等)检测均为阴性；对DHAV-1最低检出量为0.9μg, DHAV-3最低检出量为1.8 μg。试纸条在4℃、室温和37℃至少可以保存3个月；批间和批内试纸条对样品检测的重复性较好。本试验制备的试纸条与RT-PCR同时检测临床样本的阳性符合率为96.5%(111/115),阴性符合率为97.9%(46/47)。该胶体金试纸条具有较好灵敏度、特异性、重复性和稳定性。
【关键词】：鸭甲型肝炎病毒 单克隆抗体 胶体金 抗原检测
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.32
【目录】：

• 中文摘要3-4
• ABSTRACT4-6
• 常用英文缩写词汇6-13
• 文献综述13-21
• 1. 鸭病毒性肝炎研究进展概况13-18
• 1.1 引言13
• 1.2 鸭病毒性肝炎的历史与分布13-14
• 1.3 鸭肝炎病毒的病原学14
• 1.4 流行病学14
• 1.5 临床症状和病理变化14-15
• 1.6 DHAV分子生物学15
• 1.7 鸭肝炎病毒的诊断15-18
• 1.7.1 根据临床症状进行初步诊断15-16
• 1.7.2 分子生物学诊断16
• 1.7.3 血清学诊断16-18
• 2. 单克隆抗体技术18-19
• 3. 胶体金的研究概况及应用19-20
• 4. 选题目的和意义20-21
• 第一章 鸭甲型肝炎病毒单克隆抗体的制备及鉴定21-41
• 1. 材料21-23
• 1.1 细胞、菌株与毒株21
• 1.2 试验动物21
• 1.3 试剂、材料21
• 1.4 主要试剂的配制21-22
• 1.4.1 细胞培养试剂21-22
• 1.4.2 ELISA相关试剂的配制22
• 1.4.3 SDS-PAGE电泳相关溶液22
• 1.5 仪器设备22-23
• 2. 试验方法23-31
• 2.1 DHAV-1单克隆抗体的制备23-29
• 2.1.1 DHAV-1抗原的制备及纯化23-24
• 2.1.2 免疫方法24
• 2.1.3 检测DHAV-1抗体间接ELISA方法的建立24-25
• 2.1.4 SP2/0小鼠骨髓瘤细胞的培养25-26
• 2.1.5 饲养层细胞、免疫小鼠脾细胞的制备26-27
• 2.1.6 细胞融合27
• 2.1.7 杂交瘤细胞的筛选及亚克隆27-28
• 2.1.8 杂交瘤细胞的传代、冻存及复苏28
• 2.1.9 单克隆抗体的大量制备28
• 2.1.10 单克隆抗体的纯化28-29
• 2.2 单克隆抗体特性鉴定29-31
• 2.2.1 单克隆抗体亚型的鉴定29
• 2.2.2 单克隆抗体特异性鉴定29-30
• 2.2.3 杂交瘤细胞稳定性测定30
• 2.2.4 各株单抗ELISA效价测定30
• 2.2.5 单抗识别抗原位点的相加试验分析30-31
• 2.2.6 单抗亲和常数的测定31
• 3. 结果31-39
• 3.1 基于DHAV-1全病毒的间接ELISA方法的构建31-34
• 3.1.1 最佳抗原包被浓度和血清稀释度的条件优化31-32
• 3.1.2 最佳酶标抗体浓度32
• 3.1.3 最佳封闭液、封闭时间的优化32
• 3.1.4 包被条件的确定32-33
• 3.1.5 显色时间的确定33
• 3.1.6 血清孵育时间的确定33
• 3.1.7 二抗孵育时间的确定33-34
• 3.1.8 临界值的确定34
• 3.2 脾细胞、饲养细胞及SP2/0细胞34-35
• 3.3 细胞融合35
• 3.4 腹水单抗的制备和纯化35-36
• 3.5 抗体亚类鉴定36
• 3.6 细胞培养上清及腹水效价的测定36
• 3.7 杂交瘤细胞株的稳定性36-37
• 3.8 特异性37-38
• 3.9 单抗亲和常数的测定38
• 3.10 单抗抗原表位的初步鉴定38-39
• 4. 讨论39-41
• 4.1 病毒纯化39
• 4.2 细胞融合及筛选39-40
• 4.3 单抗特性40-41
• 第二章 检测1和3型鸭甲肝病毒胶体金试纸条的研制41-61
• 1. 材料41-42
• 1.1 毒株与菌株41
• 1.2 试剂、材料41
• 1.3 主要试剂的配置41
• 1.4 仪器设备41-42
• 2. 试验方法42-48
• 2.1 玻璃器皿的清洁42
• 2.2 胶体金颗粒质量鉴定42
• 2.2.1 肉眼观测42
• 2.2.2 紫外扫描鉴定42
• 2.3 待标记抗体的处理42
• 2.4 金标单克隆抗体的制备和纯化42-44
• 2.4.1 最适标记K_2CO_3的量42-43
• 2.4.2 单克隆抗体最适稳定量43-44
• 2.4.3 单克隆抗体的胶体金标记44
• 2.4.4 金标单克隆抗体的纯化44
• 2.5 试纸条最佳试验条件的优化44-45
• 2.5.1 纯化的兔抗DHAV-1 IgG的包被浓度的确定44
• 2.5.2 羊抗鼠IgG的包被浓度的确定44-45
• 2.5.3 胶体金标记的单克隆抗体的稀释度的确定45
• 2.5.4 试纸条组成材料的选择45
• 2.6 胶体金试纸的组装45-46
• 2.7 检测程序与结果判定46-47
• 2.7.1 鸭胚尿囊液或者菌体培养液的处理46
• 2.7.2 样品的处理46
• 2.7.3 样品检测的结果判定46-47
• 2.8 胶体金试纸条的检测47-48
• 2.8.1 胶体金试纸条的灵敏性试验47
• 2.8.2 胶体金试纸条的特异性试验47
• 2.8.3 胶体金试纸条的重复性试验47
• 2.8.4 胶体金试纸条的保存期试验47
• 2.8.5 临床样品的检测47-48
• 3. 结果48-56
• 3.1 胶体金溶液质量鉴定48
• 3.2 胶体金标记抗DHAV-1单抗复合物的鉴定48-49
• 3.3 金标抗体的优化49-50
• 3.3.1 胶体金最佳标记K_2CO_3的量的确定49
• 3.3.2 胶体金最佳标记蛋白量49-50
• 3.4 试纸条的优化50-52
• 3.4.1 C线浓度的优化50
• 3.4.2 金标抗体浓度的优化50-51
• 3.4.3 T线浓度优化51
• 3.4.4 NC膜的选择51
• 3.4.5 玻璃纤维素膜的选择51-52
• 3.4.6 样品垫的选择52
• 3.4.7 NC膜封闭时间的确定52
• 3.5 胶体金试纸条的检测52-56
• 3.5.1 重复性52
• 3.5.2 特异性52-53
• 3.5.3 稳定性53-54
• 3.5.4 灵敏度54-55
• 3.5.5 临床样本的检测55-56
• 4. 讨论56-61
• 4.1 胶体金试纸条的优化57-58
• 4.1.1 抗体的选择57
• 4.1.2 NC膜的优化57-58
• 4.1.3 金标的优化58
• 4.2 胶体金试纸条性能的检测58-59
• 4.3 临床样本的检测59-61
• 结论61-62
• 参考文献62-68
• 致谢68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：292213