细胞膜胆固醇对猪轮状病毒感染的影响
发布时间：2025-02-07 21:16
猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRV)是无囊膜、分节段的双股RNA病毒,隶属于呼肠孤病毒科,是引起幼年仔猪发生腹泻的主要病原之一。猪轮状病毒感染世界各地分布广泛,给养猪业造成严重的经济损火,故研究一种有效地抑制病毒感染的方法尤为重要。VP4蛋白是轮状病毒粒子中最重要的结构蛋白之一,是一种中和抗原,能够刺激动物机体产生抗病毒中和抗体,激发免疫保护,在PRV的诊断及预防中具有非常重要的作用。 本实验根据GenBank所收录的PRV JL94株VP4基因碱基序列,设计一对特异性引物,从本实验室分离鉴定的DN30209株扩增VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-pMD18-To重组质粒经测序和分析表明：DN30209株VP4全基因长2331bp,包含完整的开放阅读框,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4全长基因连接到pGEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒,标记为pGEX-6P-1-VP4。将阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大...
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 猪轮状病毒的研究进展
1.1.1 猪轮状病毒的历史研究背景
1.1.2 猪轮状病毒的流行病学特点
1.1.3 猪轮状病毒病的诊断与防治措施
1.2 猪轮状病毒的生物学进展
1.2.1 猪轮状病毒的形态及理化性质
1.2.2 猪轮状病毒的抗原及其分型
1.2.3 猪轮状病毒的细胞培养特性
1.3 猪轮状病毒蛋白及其功能研究
1.3.1 猪轮状病毒基因组的结构特征
1.3.2 猪轮状病毒结构蛋白及作用
1.3.3 猪轮状病毒非结构蛋白及其功能
1.4 脂筏研究进展
1.4.1 脂筏的概念及结构功能
1.4.2 研究脂筏与病毒感染的常用方法
1.5 细胞膜胆固醇在病毒感染中的作用
1.5.1 在包膜病毒中的作用
1.5.2 在无囊膜病毒中的作用
1.6 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒与细胞
2.1.2 实验动物
2.1.3 菌种及载体
2.1.4 试剂盒、工具酶及抗体试剂
2.1.5 主要药品及试剂
2.1.6 主要试剂配制及储存
2.1.7 仪器及设备
2.2 实验方法
2.2.1 猪轮状病VP4全长基因的克隆
2.2.2 感受态的制备
2.2.3 重组质粒VP4-pMD18-T质粒的构建
2.2.4 原核表达载体质粒pGEX-6P-1-VP4的构建
2.2.5 重组质粒pGEX-6P-1-VP4的诱导表达
2.2.6 重组蛋白的纯化及复性
2.2.7 猪轮状病毒VP4多克隆抗体的制备与鉴定
2.2.8 胆固醇对猪轮状病毒感染的影响实验
2.3 统计分析
3 结果与分析
3.1 猪轮状病毒原核表达载体的构建
3.1.1 猪轮状病毒VP4基因的克隆
3.1.2 重组质粒VP4-pMD18-T的构建及鉴定
3.1.3 重组质粒pGEX-6P-1-VP4的构建及鉴定
3.2 融合蛋白的表达与纯化
3.2.1 融合蛋白的表达
3.2.2 猪轮状病毒VP4蛋白的纯化
3.3 猪轮状病毒VP4多克隆抗体的生物活性鉴定
3.3.1 猪轮状病毒VP4多克隆抗体效价的检测
3.3.2 猪轮状病毒VP4多抗血清的间接免疫荧光检测
3.3.3 猪轮状病毒VP4多抗血.清的Western Blot检测
3.4 胆固醇对猪轮状病毒感染的影响实验
3.4.1 猪轮状病毒DN30209毒株在MA104细胞上的病变
3.4.2 胆固醇消耗对病毒感染的影响
3.4.3 胆固醇恢复对病毒感染的影响
4 讨论
4.1 猪轮状病毒VP4全基因的克隆与序列比较
4.2 猪轮状病毒VP4基因在大肠杆菌中的表达
4.2.1 猪轮状病毒VP4原核表达质粒的设计与构建
4.2.2 重组蛋白的纯化与复性
4.3 多克隆抗体血清的制备与鉴定
4.4 细胞膜中胆固醇对猪轮状病毒感染MA104细胞的影响
4.4.1 消耗细胞膜胆固醇对猪轮状病毒感染的影响
4.4.2 补充细胞膜胆固醇可使猪轮状病毒的感染力得到恢复
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：4031313
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
1.1 猪轮状病毒的研究进展
1.1.1 猪轮状病毒的历史研究背景
1.1.2 猪轮状病毒的流行病学特点
1.1.3 猪轮状病毒病的诊断与防治措施
1.2 猪轮状病毒的生物学进展
1.2.1 猪轮状病毒的形态及理化性质
1.2.2 猪轮状病毒的抗原及其分型
1.2.3 猪轮状病毒的细胞培养特性
1.3 猪轮状病毒蛋白及其功能研究
1.3.1 猪轮状病毒基因组的结构特征
1.3.2 猪轮状病毒结构蛋白及作用
1.3.3 猪轮状病毒非结构蛋白及其功能
1.4 脂筏研究进展
1.4.1 脂筏的概念及结构功能
1.4.2 研究脂筏与病毒感染的常用方法
1.5 细胞膜胆固醇在病毒感染中的作用
1.5.1 在包膜病毒中的作用
1.5.2 在无囊膜病毒中的作用
1.6 研究目的及意义
2 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 病毒与细胞
2.1.2 实验动物
2.1.3 菌种及载体
2.1.4 试剂盒、工具酶及抗体试剂
2.1.5 主要药品及试剂
2.1.6 主要试剂配制及储存
2.1.7 仪器及设备
2.2 实验方法
2.2.1 猪轮状病VP4全长基因的克隆
2.2.2 感受态的制备
2.2.3 重组质粒VP4-pMD18-T质粒的构建
2.2.4 原核表达载体质粒pGEX-6P-1-VP4的构建
2.2.5 重组质粒pGEX-6P-1-VP4的诱导表达
2.2.6 重组蛋白的纯化及复性
2.2.7 猪轮状病毒VP4多克隆抗体的制备与鉴定
2.2.8 胆固醇对猪轮状病毒感染的影响实验
2.3 统计分析
3 结果与分析
3.1 猪轮状病毒原核表达载体的构建
3.1.1 猪轮状病毒VP4基因的克隆
3.1.2 重组质粒VP4-pMD18-T的构建及鉴定
3.1.3 重组质粒pGEX-6P-1-VP4的构建及鉴定
3.2 融合蛋白的表达与纯化
3.2.1 融合蛋白的表达
3.2.2 猪轮状病毒VP4蛋白的纯化
3.3 猪轮状病毒VP4多克隆抗体的生物活性鉴定
3.3.1 猪轮状病毒VP4多克隆抗体效价的检测
3.3.2 猪轮状病毒VP4多抗血清的间接免疫荧光检测
3.3.3 猪轮状病毒VP4多抗血.清的Western Blot检测
3.4 胆固醇对猪轮状病毒感染的影响实验
3.4.1 猪轮状病毒DN30209毒株在MA104细胞上的病变
3.4.2 胆固醇消耗对病毒感染的影响
3.4.3 胆固醇恢复对病毒感染的影响
4 讨论
4.1 猪轮状病毒VP4全基因的克隆与序列比较
4.2 猪轮状病毒VP4基因在大肠杆菌中的表达
4.2.1 猪轮状病毒VP4原核表达质粒的设计与构建
4.2.2 重组蛋白的纯化与复性
4.3 多克隆抗体血清的制备与鉴定
4.4 细胞膜中胆固醇对猪轮状病毒感染MA104细胞的影响
4.4.1 消耗细胞膜胆固醇对猪轮状病毒感染的影响
4.4.2 补充细胞膜胆固醇可使猪轮状病毒的感染力得到恢复
5 结论
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
本文编号：4031313
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/4031313.html
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