六邻体嵌合型重组5型腺病毒载体复制和包装机理的研究

发布时间：2017-10-10 09:11

  本文关键词：六邻体嵌合型重组5型腺病毒载体复制和包装机理的研究

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【摘要】：重组5型腺病毒(recombinant adenovirus type5, rAd5)作为基因治疗和疫苗载体具有多重优势，然而，预存免疫的存在会显著的降低该种血清型腺病毒载体的转导效率以及转基因表达水平，限制腺病毒作为疫苗以及基因治疗载体的应用。利用基因工程改造腺病毒载体，将rAd5表面主要结构蛋白六邻体的7个高突变区(HVR区)选择性地与稀有血清型六邻体的相应区域相嵌合是帮助rAd5逃避预存免疫的有效方法。限制这一方法的主要问题是这种嵌合改造过程繁琐，而且与rAd5相比，许多嵌合改造的方案都降低了嵌合型腺病毒的包装效率和复制水平，甚至导致改造后的腺病毒不能包装。与此相关的病毒复制和包装机理有待进一步的研究。 本论文在课题组前期工作的基础上，首先通过对几种与人D亚群腺病毒(37型、43型)六邻体HVR区嵌合的重组5型腺病毒[Ad5-GFP、Ad5-37(5,7)-GFP、Ad5-43(5,7)-GFP]复制水平的分析，以及对几种六邻体嵌合型重组5型腺病毒骨架质粒[Ad5、Ad5-37(5,7)、Ad5-43(5,7)、Ad5-37(1-7)、Ad5-43(1-7)]蛋白表达量的检测发现，对腺病毒六邻体的改造影响了六邻体在细胞内的丰度和聚集状态，最终导致嵌合腺病毒的复制水平和包装效率的降低。接着，为了更深入地了解嵌合改造的腺病毒六邻体对其生物活性的影响，我们构建了相应的几种嵌合型六邻体的真核表达质粒[5Hexon、5Hexon-37(5,7)、5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(5,7)、5Hexon-43(1-7)]，检测了几种嵌合型六邻体与其伴侣蛋白5型腺病毒L4-100K(5-100K)的相互作用。通过对5-100K对六邻体表达量、形成三聚体及进入细胞核三个方面的影响进行检测，我们发现，虽然嵌合改造后的5型腺病毒六邻体都能够在5型L4-100K的帮助下提高表达量，但是不同的改造方案却不同程度地影响了嵌合六邻体在5型L4-100K的帮助下形成三聚体的效率以及进入细胞核的效率，而这些改变也和嵌合型腺病毒包装重组效率以及复制水平的改变是一致的。最后，我们将5型L4-100K(5-100K)更换成D亚群L4-100K(D-100K)，并重新检测了D-100K与几种嵌合型六邻体[5Hexon-37(1-7)、5Hexon-43(1-7)]的相互作用，发现血清型特异性在嵌合型六邻体形成三聚体的过程中并不是主要影响因素，进一步确定了HVR区嵌合对腺病毒六邻体自身形成三聚体的稳定性造成影响，从而改变了嵌合型腺病毒包装重组效率和复制水平。 本论文的研究表明，，对腺病毒六邻体的嵌合改造影响了六邻体自身形成三聚体的稳定性，使得嵌合六邻体在其伴侣蛋白L4-100K的帮助下形成三聚体和进入细胞核参与组装的效率改变，是六邻体的嵌合改造影响腺病毒包装效率和复制水平的主要原因，并且阐明了相关的腺病毒包装机理。另外，通过本论文的研究，我们建立了一种新的有效评价六邻体嵌合方案的平台，即通过检测六邻体与L4-100K相互作用来评价和预测嵌合改造腺病毒六邻体的策略对病毒包装复制影响的快速有效方法。通过该方法能够有效排除影响腺病毒包装复制的嵌合改造方案，大大提高了对腺病毒六邻体进行改造后得到六邻体嵌合型重组腺病毒的成功率。
【关键词】：重组腺病毒载体 六邻体嵌合 L4-100K HVR
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R450;R373
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 腺病毒简介12-16
• 1.1.1 腺病毒的结构和分类12-13
• 1.1.2 腺病毒的复制周期13-15
• 1.1.3 腺病毒衣壳的装配15-16
• 1.2 腺病毒载体的应用16-19
• 1.2.1 腺病毒载体简介17
• 1.2.2 腺病毒载体的特点和面临的问题17-18
• 1.2.3 腺病毒载体逃避预存免疫的方法和现有方法的局限18-19
• 1.3 论文设计19-22
• 1.3.1 立题依据19-21
• 1.3.2 实验方案21-22
• 第二章 实验材料与方法22-34
• 2.1 实验材料、仪器设备与常用试剂22-30
• 2.1.1 实验材料22-24
• 2.1.2 仪器设备24
• 2.1.3 常用试剂和缓冲液配置24-30
• 2.2 实验方法30-34
• 2.2.1 六邻体嵌合型重组 5 型腺病毒的筛选30-31
• 2.2.2 六邻体嵌合型重组 5 型腺病毒的感染和扩增31
• 2.2.3 六邻体嵌合型重组 5 型腺病毒滴度的测定31-32
• 2.2.4 病毒骨架质粒蛋白表达量的测定32-33
• 2.2.5 嵌合六邻体三聚体形成效率的测定33
• 2.2.6 嵌合六邻体进入细胞核效率的测定33-34
• 第三章 实验结果与讨论34-58
• 3.1 六邻体嵌合型重组 5 型腺病毒的产率34-37
• 3.2 六邻体嵌合型重组 5 型腺病毒骨架质粒蛋白表达效率37-40
• 3.3 嵌合六邻体和其伴侣蛋白 L4-100K 真核质粒的构建40-46
• 3.3.1 六邻体伴侣蛋白 100K 真核质粒的构建40-42
• 3.3.2 重组 5 型腺病毒六邻体真核质粒的构建42-43
• 3.3.3 嵌合型 5 型六邻体真核质粒的构建43-46
• 3.4 嵌合六邻体形成三聚体的效率46-50
• 3.4.1 六邻体伴侣蛋白 L4-100K 的真核表达46
• 3.4.2 嵌合六邻体真核质粒的真核表达46-48
• 3.4.3 嵌合六邻体形成三聚体的效率48-50
• 3.5 血清型特异性对嵌合六邻体与 L4-100K 的相互作用的影响50-54
• 3.5.1 D 亚群六邻体伴侣蛋白 L4-100K 真核质粒的构建50-51
• 3.5.2 37 型腺病毒六邻体真核质粒的构建51-52
• 3.5.3 D-100K 和 37 型六邻体的表达52-53
• 3.5.4 血清型的改变在六邻体与 L4-100K 相互作用中的影响53-54
• 3.6 嵌合六邻体进入细胞核的效率54-58
• 结论58-60
• 展望60-61
• 参考文献61-64
• 作者简历64-65
• 致谢65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 谭耀驹;谢菲;;腺病毒分型诊断研究进展[J];广东医学;2008年01期

本文编号：1005515