CoxA16抗原检测试剂研究及初步应用

发布时间：2017-10-13 17:02

  本文关键词：CoxA16抗原检测试剂研究及初步应用

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【摘要】：柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16, CoxA16)是引起儿童手足口病(Hand, Foot and Mouth Disease, HFMD)的主要病原之一。大多研究显示HFMD重症及死亡病例多由肠道病毒71型(Enterovirus71, EV71)引起,因而对CoxA16研究相对较少。近年来,越来越多的研究指出CoxA16除引起HFMD普通病例外,也能引起心肌炎、心包炎、难治性休克及致死性肺炎等重症病例,因此针对CoxA16疫苗研发及病原学诊断的研究在HFMD的公共卫生防控体系中具有重要的意义。 建立一套灵敏、特异、稳定、重复性好的病原检测体系是CoxA16疫苗研究的关键技术之一,作为一种常规检测病原微生物的方法,ELISA因其快速、灵敏、经济及可规模化的优点广泛应用于病原检测中,同时能够简便地应用于CoxA16流行病学调查和临床病原检测。本研究以多抗为基础建立CoxA16抗原检测的双抗体夹心ELISA法,通过方阵法和单因素法分别对ELISA体系的包被抗体浓度、酶标抗体浓度、包被液、封闭液、封闭时间、样品孵育时间、酶标抗体孵育时间、显色液及显色时间等条件进行优化,确定优化的ELISA检测体系。 本研究制备了一套灵敏度参比品、特异性参比品、精密性参比品及抗原含量检测参比品,根据《中华人民共和国药典》二部“药品质量标准分析方法验证指导原则”对检测方法的线性、灵敏度、特异性、精密度和稳定性等技术指标进行验证。最终建立的CoxA16抗原ELISA检测体系在7U/ml-57U/ml范围直线线性关系最佳,决定系数(R2)达0.995以上;最低检测下限为7.1U/ml,可检测到2×102～9×103CCID50活病毒；能检测到10株分离自不同地区的CoxA16病毒,与CoxA16以外的10种肠道病毒无交叉反应；变异系数CV%小于15%。使用荧光PCR、中和法及本研究建立的ELISA抗原检测法检测病毒培养液,显示三种检测结果一致性好；将建立的方法初步应用于CoxA16纯化工艺研究,能够较好的监控病毒出峰时间及病毒抗原含量。
【关键词】：手足口病 肠道病毒 柯萨奇病毒A组16型 酶联免疫吸附试验 吸收实验
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R373.23;R392
【目录】：

• 目录3-5
• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 前言7-15
• 1 CoxA16流行情况7-8
• 2 CoxA16基因组结构及分型8-9
• 3 病毒感染繁殖9-10
• 4 临床感染症状10
• 5 病毒致病机制与机体免疫保护10-12
• 6 CoxA16诊断试剂研究现状和应用12-13
• 6.1 病毒分离12
• 6.2 血清学抗体检测12-13
• 6.3 病毒的分子诊断13
• 7 课题研究意义、目的和思路13-15
• 材料与方法15-28
• 1 实验材料15-18
• 1.1 实验动物15
• 1.2 毒株15
• 1.3 细胞15
• 1.4 主要试剂及配制15-18
• 1.5 所用材料18
• 1.6 主要仪器18
• 2 实验方法18-28
• 2.1 抗CoxA16血清的制备及检测18-20
• 2.2 CoxA16-IgG制备及检测20-22
• 2.3 HRP标记CoxA16-IgG及检测22-23
• 2.4 ELISA检测体系的建立23-24
• 2.5 参比品的制备24-26
• 2.6 检测试剂主要技术指标验证26
• 2.7 应用26-28
• 结果与分析28-44
• 1 抗CoxA16血清相关检测28-29
• 1.1 兔抗CoxA16血清中和抗体效价28-29
• 1.2 交叉吸收实验29
• 2 CoxA16-IgG相关检测29-30
• 2.1 纯度检测29
• 2.2 蛋白含量检测29-30
• 3 酶标抗体检测30-31
• 3.1 酶标抗体定量检测30-31
• 3.2 酶标抗体效价31
• 4 反应条件的选择31-35
• 4.1 包被浓度和酶标抗体浓度优化31-32
• 4.2 包被液与封闭液的优化32-33
• 4.3 封闭条件优化33-34
• 4.4 样品孵育时间与酶标抗体孵育时间的优化34
• 4.5 底物的选择34-35
• 4.6 底物反应条件优化35
• 5 标准品的制备35-39
• 5.1 灵敏度参比品35-36
• 5.2 精密性参比品36
• 5.3 特异性参比品36-37
• 5.4 定量参比品37-39
• 6 ELISA体系评价39-41
• 6.1 检测下限、线性和直线性39-41
• 6.2 灵敏度、特异性、精密度及稳定性验证41
• 7 应用41-44
• 7.1 CoxA16灭活疫苗工艺研究的应用41-42
• 7.2 与荧光PCR法、中和法结果比较42-44
• 讨论44-49
• 1 高效价抗体的制备44-45
• 2 ELISA检测体系的建立45-46
• 3 参考品的制备46-47
• 4 体系的标化47
• 5 应用47
• 6 展望47-49
• 小结49-50
• 参考文献50-53
• 附录 主要缩略词表53-54
• 致谢54-55
• 个人简历55-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1026014