GeXP多基因遗传表达系统检测人TCRVα和TCRVβ链CDR3谱型及长度的方法建立以及初步应用

发布时间：2017-10-14 06:33

  本文关键词：GeXP多基因遗传表达系统检测人TCRVα和TCRVβ链CDR3谱型及长度的方法建立以及初步应用

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【摘要】：目的：利用GeXP多重基因表达系统建立两种多重逆转录-聚合酶链式反应(mRT-PCR)的方法，分别检测TCR Vα和TCR Vβ链的CDR3谱型及长度，用于分析T细胞克隆增殖情况。分析肺癌患者胸水中TIL的TCR Vα和TCR Vβ家族的克隆增殖情况，并克隆具有寡克隆或单克隆增生现象的TCR Vα和TCR Vβ基因构建重组嵌合型腺病毒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。研究此TCR Vα和TCRVβ基因修饰的PBMC对不同肿瘤细胞的杀伤作用，确定是否为肺癌相关的TCR基因，为以后发现肿瘤特异性TCR基因并利用特异性TCR基因修饰T细胞进行过继免疫治疗打下基础。 方法： 一、收集正常人外周血，分离出单核细胞，提取总RNA，利用GeXP多重基因表达系统建立多重逆转录-聚合酶链式反应的方法检测人PBMC中22个TCR Vβ家族的CDR3的谱型和长度，用于分析亚家族的比例以及克隆增殖情况。 二、收集正常人外周血，分离出单核细胞，提取总RNA，利用GeXP多重基因表达系统建立多重逆转录-聚合酶链式反应的方法检测人PBMC中32个TCR Vα亚家族的CDR3的谱型长度，用于分析亚家族的克隆增殖情况。 三、收集肺癌患者胸水，分离出单核细胞，提取总RNA，利用上述建立的两种方法分析肺癌患者胸水中TIL的TCR Vβ家族和TCR Vα家族的克隆增殖情况。 四、提取肺癌患者胸水单核细胞的总RNA，克隆肺癌患者胸水TIL中呈现寡克隆增殖的的TCR Vβ基因和TCR Vα基因，并构建腺病毒穿梭质粒 pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ。 五、通过Lipofectamine2000脂质体转染的方法，将腺病毒骨架质粒与构建的腺病毒穿梭质粒pDC315-TCRVα-IRES-TCRVβ共转染HEK293细胞，包装表达目的基因的重组腺病毒。获得的初病毒提取病毒基因组DNA，PCR扩增目的基因。用病毒转染淋巴细胞，检测目的基因表达情况。将鉴定正确的重组嵌合型腺病毒进行大量扩增，过滤TCID50法测病毒滴度。用重组腺病毒感染PBMC，36小时后分别作用于肺癌细胞株NCI-H1299（HLA-A2+）、NCI-H1299（HLA-A2-）、肝癌细胞株HepG2（HLA-A2+），7402（HLA-A2-）。用MTT法在12h、24h、36h三个时间点检测杀伤效果。 结果：成功地利用GeXP多重基因表达系统建立两种多重逆转录-聚合酶链式反应(mRT-PCR)的方法，检测出22个TCR Vβ家族以及32个TCR Vα家族CDR3长度以及谱型情况。GeXP检测5例肺癌患者胸水中TIL的TCR Vβ家族和TCR Vα家族的CDR3谱型，结果显示除P2病人所有家族均为多克隆外，其余四例患者均出现单克隆性或寡克隆性增生的现象，通过测序，P1寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD2-TRBJ2S1)和TRAV26(TRAV26-TRAJ20)；P3寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV17(TRAV17-TRAJ20)；P4寡克隆增生的TRBV21(TRBV21-TRBD1-TRBJ2S1)和TRAV7(TRAV7-TRAJ5)；P5单克隆增生的TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)和TRAV5(TRAV5-TRAJ27)。从P5患者中成功克隆获得TCR Vα5和TCR Vβ17基因，并正确构建了重组腺病毒穿梭质粒pDC315-TCR Vα5-IRES-TCR Vβ17。通过Lipofectamine2000脂质体转染的方法，利用腺病毒包装细胞包装重组腺病毒。提取重组腺病毒基因组，PCR扩增得到Fiber35和TCR Vβ17基因，说明目的基因已经整合到病毒基因组中。病毒感染PBMC后流式检测，目的基因得到有效表达。用重组腺病毒感染PBMC后，进行抗肿瘤细胞实验，发现经TCRVα5-TCRVβ17基因转染的PBMC的抗肿瘤能力为NCI-H1299(HLA-A2+)HepG2(HLA-A2+)NCI-H1299(HLA-A2-)7402(HLA-A2+)。 结论：GeXP检测五例肺癌患者TIL，均出现了TCR Vα和TCR Vβ家族的寡克隆或单克隆增生的现象（除P2），推测可能是由于在肿瘤局部的特异性抗原诱导产生的。从肺癌患者胸水中克隆获得TRAV5（TRAV5-TRAJ27）和TRBV17(TRBV17-TRBD2S2-TRBJ2S1)基因，并成功构建了重组腺病毒载体。杀伤实验显示重组TCR腺病毒感染的PBMC对两株肺腺癌细胞株均具有杀伤效果，但对HLA-A2+肺腺癌细胞的杀伤效率明显高于HLA-A2-肺腺癌细胞，并且对非肺癌细胞7402细胞没有杀伤效果，，说明该寡克隆增生的TCR Vα和TCR Vβ家族是由肺癌引起的特异性增殖T细胞。
【关键词】：GeXP TCR 重组腺病毒 Vα5 Vβ17
【学位授予单位】：广东药学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R3416
【目录】：

• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-19
• 第一部分 GeXP 多重基因分析系统检测人 TRBV 亚家族 CDR3 谱系方法的建立19-42
• 引言19
• 1.1 实验材料19-21
• 1.1.1 实验样本19
• 1.1.2 实验试剂19-20
• 1.1.3 实验仪器20-21
• 1.2 实验方法21-32
• 1.2.1 实验标本的收集21
• 1.2.2 单核细胞的分离21
• 1.2.3 GeXP 多重基因检测系统检测人淋巴细胞 TCRVβ亚家族方法建立21-25
• 1.2.4 RT-mPCR 条件的优化25-27
• 1.2.5 GeXP 检测系统的检验27-32
• 1.3 结果32-40
• 1.3.1 管家基因 GAPDH RT 引物的优化32-34
• 1.3.2 内参基因 KanR 加入模版浓度的优化34-35
• 1.3.3 阳性质粒模版的构建35-36
• 1.3.4 单引物多模板扩增特异性36-37
• 1.3.5 多引物多模板扩增的特异性37-38
• 1.3.6 健康人 PBMC TCR Vβ亚家族 GeXP 检测38-40
• 1.4 小结40-42
• 第二部分 GeXP 多重基因分析系统检测人 TRAV 亚家族 CDR3 谱系的方法建立42-52
• 前言42
• 2.1 实验材料42
• 2.1.1 实验样本42
• 2.1.2 实验试剂42
• 2.1.3 实验仪器42
• 2.2 实验方法42-47
• 2.2.1 实验标本的收集42-43
• 2.2.2 单核细胞的分离43
• 2.2.3 GeXP 多重基因检测系统检测人淋巴细胞 TCRVα家族 CDR3 谱系的方法建立43-46
• 2.2.4 GeXP 检测系统的检验46-47
• 2.3 结果47-51
• 2.3.1 单引物扩增的特异性47-48
• 2.3.2 健康人 PBMC TCR Vα亚家族 GeXP 检测48-51
• 2.4 小结51-52
• 第三部分 肺癌患者胸水 TIL 中 TCR 家族 CDR3 谱型的初步分析52-58
• 前言52
• 3.1 实验材料52-53
• 3.1.1 实验样本52-53
• 3.1.2 实验试剂53
• 3.1.3 实验仪器53
• 3.2 实验方法53-55
• 3.2.1 实验标本的收集53
• 3.2.2 RNA 的提取53
• 3.2.3 第一链 cDNA 的合成53
• 3.2.4 多重 PCR 分别扩增病人胸水中 TIL 中 TCR Vα和 TCR Vβ的 CDR3 片段53-54
• 3.2.5 GeXP 上机检测54
• 3.2.6 寡克隆增殖亚家族 CDR3 片段序列分析54-55
• 3.3 结果55-57
• 3.3.1 肺癌患者胸水中 TIL 中 TCR Vα和 TCR Vβ的 CDR3 谱型 GeXP 分析55-56
• 3.3.2 5 例肺癌病人胸水 TIL 中 TCR Vα和 TCR Vβ家族寡克隆或单克隆测序56-57
• 3.4 小结57-58
• 第四部分 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 双表达载体的构建58-70
• 引言58
• 4.1 材料58-59
• 4.1.1. 质粒、菌株、试剂58-59
• 4.1.2 仪器59
• 4.2 方法59-65
• 4.2.1 TCR Vα5 、TCR Vβ17 基因的获取59-61
• 4.2.2 胶回收 PCR 产物连接 T 载体61
• 4.2.3 质粒转化及质粒提取61-62
• 4.2.4 构建 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 双表达穿梭载体62-65
• 4.3 结果65-69
• 4.3.1 获取 TCR Vα5 、TCR Vβ17 基因65-66
• 4.3.2 TCR Vα5 、TCR Vβ17 基因连接 T 载体测序结果66
• 4.3.3 构建 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 双表达穿梭载体结果66-69
• 4.5 小结69-70
• 第五部分 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35 的包装、鉴定以及滴度测定和 TCR Vβ17、TCR Vα5 重组腺病毒的抗瘤谱70-78
• 引言70
• 5.1 材料70
• 5.1.1 质粒、细胞和试剂70
• 5.1.2 仪器70
• 5.2 方法70-73
• 5.2.1 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35，pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 的包装70-71
• 5.2.2 重组嵌合型腺病毒鉴定71-73
• 5.2.3 重组腺病毒抗瘤谱73
• 5.3 结果73-77
• 5.3.1 HEK-293 细胞包装腺病毒73-74
• 5.3.2 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35. TCR Vβ17 的 PCR 鉴定74
• 5.3.3 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35. pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 流式鉴定74-75
• 5.3.4 重组嵌合型腺病毒 Ad5/F35 pDC315-AV5-AJ27-IRES-BV17-BJ2.1 扩大培养75
• 5.3.5 肿瘤细胞株中 HLA 分型75-76
• 5.3.6 MTT 比色法检基因 TCR Vα5、Vβ17 重组腺病毒对肿瘤细胞的杀伤效果76-77
• 5.4 小结77-78
• 讨论78-82
• 参考文献82-89
• 附录一 英文缩略词表89-90
• 附录二 质粒图谱90-92
• 附录三 攻读学位期间发表的论文92-93
• 致谢93

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;Analysis of the CDR3 Length Repertoire and the Diversity of TCRα Chain in Human Peripheral Blood T Lymphocytes[J];Cellular & Molecular Immunology;2007年03期

2 周昕熙,李锦添,吴一龙,王思愚,杨学宁,陈诗萍;非小细胞肺癌患者T细胞受体Vβ表达和克隆性研究[J];中国肺癌杂志;2003年02期

3 李惠芳,万远廉,刘玉村,汤坚强,吴涛,张英,朱平;直肠癌肿瘤浸润性淋巴细胞中T细胞受体基因谱型特征[J];中国优生与遗传杂志;2003年06期

本文编号：1029537