慢病毒介导ZnT1基因RNAi对神经元BDNF分泌的影响以及自噬凋亡在脊髓损伤后的动态变化

发布时间：2017-11-11 17:25

  本文关键词：慢病毒介导ZnT1基因RNAi对神经元BDNF分泌的影响以及自噬凋亡在脊髓损伤后的动态变化

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【摘要】：目的 设计针对SD大鼠的锌离子转运蛋白1（ZnT1）的siRNA序列，将ZnT1-siRNA序列插入到pFU-GW-iRNA质粒中，包装慢病毒载体，探讨其对神经元最有效的转染条件并明确不同siRNA序列对神经元ZnT1基因表达的抑制作用。在由不同ZnT1-siRNA序列构建的慢病毒载体保证的对ZnT1的不同抑制率的条件下，通过对神经元BDNFmRNA以及蛋白的表达检测，揭示ZnT1对BDNF/Trkb信号通路的调控作用，阐明锌调控BDNF/TrKB信号通路，促进BDNF分泌的机制。观察在体水平下，SCI后凋亡自噬相关基因的动态变化情况，揭示SCI后凋亡与自噬之间的关系，同时观察SCI后自噬基因与ZnT1的变化情况，揭示两者的统计学关系，探讨自噬在SCI后锌转运代谢中的作用。 方法 1：通过Genbank获得SD大鼠ZnT1基因序列，按照siRNA设计原则设计3条针对ZnT1的siRNA序列与一条阴性对照（A, B, C, NC），序列两端含有HpaⅠ与XhoⅠ酶切位点，将pFU-GW-iRNA双酶切使之线性化，将3条针对ZnT1的siRNA分别插入pFU-GW-iRNA构建重组质粒（A,B,C,NC），获得的重组质粒行测序鉴定。 2：将获得的重组质粒与慢病毒辅助包装颗粒pHelper1.0、 pHelper2.0共转染HEK293T细胞，收获病毒液，根据转染质粒的不同，获得的病毒分别命名LV-ZnT1/shRNA-NC, LV-ZnT1/shRNA-A, LV-ZnT1/shRNA-B和LV-ZnT1/shRNA-C，获得的病毒行滴度测定。 3：采用酶消化法体外培养SD大鼠神经元细胞，神经特异性烯醇酶（NSE）细胞免疫组化鉴定其为神经细胞，按照感染复数MOI=1,3,6,8分别转染LV-ZnT1/shRNA-NC, LV-ZnT1/shRNA-A, LV-ZnT1/shRNA-B和V-ZnT1/shRNA-C病毒，转染后72h荧光显微镜下观察转染效率，，获取最佳的转染MOI值，收获最佳MOI值下的受感染神经元，Western blot技术检测神经元中ZnT1的表达情况，确定各个序列对ZnT1基因表达的抑制率。 4：将LV-ZnT1/shRNA-NC, LV-ZnT1/shRNA-A, LV-ZnT1/shRNA-B以及LV-ZnT1/shRNA-C病毒分别按照最佳的MOI值转染神经元，实验分为细胞未处理组（CON组），阴性对照组（NC组），干扰组（ZnT1-siRNA组，其中按照转染干扰序列不同又分为ZnT1-siRNA-A组，ZnT1-siRNA-B组，ZnT1-siRNA-C组），72h后观察转染效率并收集细胞，使用RT-PCR, Western blot技术检测神经元中ZnT1与BDNF在mRNA与蛋白两个水平的表达变化情况；ELISA法检测培养液上清中BDNF的浓度，同时MTT法检测神经元活力的变化情况。 5：选取192只大鼠样本，动物按随机数目表法分为：假手术组：仅接受椎板切除术，不损伤脊髓（n=72）；SCI组：于T10水平使用Allen’s撞击器（60g.cm）制作SCI模型（n=122）。假手术组与SCI组按取材时间不同为伤后1h,2h,6h,12h,24h,3d,7d。透射电镜技术检测各个时间点神经元微结构的变化情况，同时利用RT-PCR与Western blot技术检测各个时间点LC3Ⅱ/LC3Ⅰ, Bax,Bcl-2, Caspase-3以及ZnT1的表达变化情况。 结果 1：设计了3条（A,B,C）针对SD大鼠锌转运蛋白1（ZnT1）的siRNA序列以及一条阴性对照序列（NC），成功的将其插入pFU-GW-iRNA质粒中并构建了慢病毒载体，获得了8×108TU/mL的病毒液，其在MOI=6时对神经细胞具有最佳的转染效率（93%）并能保持神经细胞良好的生存状态，不同序列的siRNA均能实现对ZnT1表达的有效抑制，抑制率分别为47.74±1.40%，81.19±1.36%，94.10±2.41%。 2：A, B, C三种siRNA对神经元的ZnT1mRNA的抑制率分别为34.82±9.35%，42.98±4.85%，65.78±1.71%；对ZnT1蛋白的抑制率分别为32.11±1.70%，39.57±2.55%，63.15±3.82%。神经元BDNF的表达量发生下降，结果发现：BDNFmRNA的表达量下降了14.91±1.80%，24.46±4.11%，37.10±4.35%；BDNF蛋白的表达量下降了36.94±2.09%,22.09±1.79%,46.92±1.91%。在mRNA与蛋白水平，ZnT1与BDNF抑制率之间均存在正相关关系（mRNA水平：Spearman rho=0.787，P0.01；蛋白水平：Spearman rho=0.453，P=0.030）。ELISA检测结果显示：ZnT1-siRNA各个组中的BDNF含量均有所下降，与CON组以及NC组相比均存在统计学差异（P0.05），CON组与NC组之间上清液的BDNF含量之间不存在统计学差异（P=0.785）。MTT检测发现：慢病毒介导ZnT1-RNAi并没有引起各组神经元生存活力的变化，各组之间不存在统计学差异（P0.05）。 3：脊髓损伤后2h电镜下可见内质网肿胀，线粒体空泡化等损伤表现，损伤后24h在细胞内即可见自噬小体形成，呈双层或多层膜结构包裹线粒体等细胞器。自噬标志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表达升高，同时凋亡相关基因Bax, Caspase-3表达升高，自噬与凋亡之间存在正相关关系：在LC3Ⅱ/LC3Ⅰ与Bax之间，蛋白水平上，Spearman rho=0.448, P=0.014；RNA水平上，Spearman rho=0.787,P0.01；在LC3Ⅱ/LC3Ⅰ与Caspase-3之间，蛋白水平上，Spearman rho=0.397,P=0.027；RNA水平上，Spearman rho=0.641, P0.01。抗凋亡基因Bcl-2在SCI后表达升高，而随着凋亡自噬相关基因表达到达高峰，Bcl-2的表达反而被抑制，出现了Bcl-2表达的低谷。 4：Western blot检测发现：在SCI后的24h之内，ZnT1的表达与自噬标志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）存在表达变化趋势的一致性，在SCI仅仅1h后即开始升高，在6h左右两者的表达开始出现下降，在12h以后两者的表达升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在24h出现高峰，而ZnT1的表达则持续升高，并且在SCI后的24h之内，自噬标志性基因LC3Ⅱ/LC3Ⅰ与ZnT1之间存在正相关关系，Spearmanrho=0.829, P=0.042。 结论 1：设计了3条针对SD大鼠锌转运蛋白1（ZnT1）的siRNA序列，并成功构建了慢病毒载体，MOI=6时对神经元的转染效率高，虽然不同siRNA序列对ZnT1表达的抑制效率存在差异，但是均能有效的实现对神经元ZnT1表达的抑制。 2： ZnT1表达的抑制导致了神经元BDNF分泌的减少，在mRNA以及蛋白水平，两者在抑制率上均存在正相关关系，同时各组之间的神经元活力没有差异，说明了ZnT1具有调控BDNF表达的生物学效应，提示锌调控BDNF的分泌是由ZnT1介导。 3：损伤脊髓中出现自噬体的形成，自噬标志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）表达升高，同时凋亡相关基因Bax，Caspase-3表达升高，自噬与凋亡之间存在正相关关系，抗凋亡机制在SCI后启动以保护损伤脊髓，但在自噬凋亡的高峰期受其抑制，说明SCI后自噬与凋亡被激活，两者是相互联系的，由于在时间上凋亡晚于自噬，所以自噬有可能存在促进凋亡发生的作用。 4：SCI后的24h之内，ZnT1的表达与自噬标志性基因（LC3Ⅱ/LC3Ⅰ）存在表达变化趋势的一致性，两者之间存在正相关关系，提示自噬在SCI后的激活有可能在SCI后锌的转运与代谢过程中存在着某种作用。
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R363

【参考文献】

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1 陈鹏;王秀丽;李景贺;贾娇媛;卢爱萍;姜玉珍;;DcR3 mRNA在白血病细胞中的表达及意义[J];吉林大学学报(医学版);2007年06期

2 刘朝晖;杨宇;庄鹏辉;许杰华;马延兵;胡海涛;;反转录病毒载体介导的EGFP基因在SK-N-SH神经母细胞瘤细胞中的表达[J];西安交通大学学报(医学版);2007年01期

3 姜海艳;王玉梅;关伟军;;乳腺癌多药耐药机制及RNAi技术的应用[J];中国实验诊断学;2009年04期

本文编号：1172362