恒河猴MyD88和TRAM双基因沉默siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

发布时间：2017-12-15 04:26

  本文关键词：恒河猴MyD88和TRAM双基因沉默siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

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【摘要】：[目的]构建恒河猴MyD88和TRAM双基因沉默siRNA慢病毒载体并感染293T细胞进行鉴定和包装。 [方法] (一)分别通过4对siRNA与真核质粒载体连接得到恒河猴MyD88RNAi真核质粒载体及恒河猴TRAMRNAi真核质粒载体。 (二)通过目的基因恒河猴MyD88和TRAM与真核质粒载体连接得到目的基因恒河猴MyD88和TRAM过表达真核质粒载体。 (三)恒河猴MyD88和TRAM过表达真核质粒载体转染293T细胞后做Western blot检测二者的表达情况。 (四)通过恒河猴MyD88RNAi真核质粒载体与恒河猴MyD88过表达真核质粒载体及恒河猴TRAMRNAi真核质粒载体与TRAM过表达真核质粒载体分别共转染293T细胞后做Western blot检测筛选有效恒河猴MyD88RNAi真核质粒载体和恒河猴RAMRNAi真核质粒载体。 (五)将有效恒河猴MyD88RNAi真核质粒载体和恒河猴TRAMRNAi真核质粒载体共同与慢病毒载体连接得到恒河猴MyD88siRNA和TRAMsiRNA慢病毒载体,经PCR鉴定后感染293T细胞进行包装。 [结果]通过真核质粒外筛得到有效的siRNA靶点,分别是：恒河猴MyD88siRNA序列为GAGGAAGAAAGTCGTGGCTTT,恒河猴TRAMsiRNA序列为AAGTACAAGGCAATGAAGAAA,再共同与慢病毒载体连接成功构建了恒河猴MyD88和TRAMsiRNA慢病毒载体。 [结论]通过siRNA与慢病毒载体连接成功构建恒河猴MyD88和TRAMsiRNA慢病毒载体,为后续实验应用于感染未成熟树突状细胞,进一步研究恒河猴肝移植免疫耐受奠定了实验基础。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R392

【参考文献】

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1 朱旭辉;杨明金;陈涛涌;;CMRF35样分子对Toll样受体信号通路的影响及其机制的研究进展[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2011年01期

2 张黎;胡明道;陈鹏;;Toll样受体信号传导通路及其在器官移植中作用的研究进展[J];中国普外基础与临床杂志;2012年11期

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本文编号：1290635